fenobarbiturat memiliki waktu retensi yang lebih cepat, karena sebagian analit kemungkinan masih berada dalam bentuk garam ion yang lebih menyukai fase
gerak, sehingga menyebabkan pemisahannya dengan parasetamol tidak sempurna. Berdasarkan tabel IV, pada komposisi fase gerak 90 : 10, kedua kecepatan
alir yang dioptimasi memberikan hasil yang memenuhi persyaratan resolusi 1,5. Akan tetapi kecepatan alir yang dipilih adalah 1,5 mlmenit. Alasan pemilihan ini
adalah karena kecepatan alir 1,5 mlmenit memiliki tingkat reprodusibilitas yang lebih baik daripada kecepatan alir 1 mlmenit, hal ini terlihat pada besarnya standar
deviasi dari resolusi yang dihasilkan dari tiga kali replikasi. Selain itu, waktu retensi asam fenobarbiturat
lebih pendek pada kecepatan alir 1,5 mlmenit dibanding kecepatan alir 1 mlmenit karena adanya tekanan yang lebih besar pada kolom. Hal
ini sangat penting untuk efisiensi waktu kerja dalam analisis. Dengan demikian, selanjutnya analisis campuran parasetamol dan natrium
fenobarbital dengan metode KCKT menggunakan fase gerak metanol : buffer fosfat pH 3,2 dengan perbandingan 90 : 10 dan kecepatan alir 1,5 mlmenit.
E. Optimasi Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium Fenobarbital
dengan KCKT Fase Terbalik
Pembuatan kurva baku parasetamol dan natrium fenobarbital untuk penetapan kadar dilakukan sebanyak 3 kali replikasi. Persamaan kurva baku yang
diperoleh menyatakan hubungan yang linier antara konsentrasi analit dengan AUC Area Under the Curve yang dihasilkan. Parameter linearitas yang digunakan adalah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
koefisien korelasi r, yang menunjukkan korelasi atau hubungan antara konsentrasi dengan AUC. Dari ketiga replikasi kurva baku yang diperoleh, kemudian dipilih satu
kurva yang kemudian akan digunakan untuk analisis kuantitatif senyawa tersebut. Pemilihan kurva baku didasarkan pada nilai r- nya yang lebih besar dari r tabel untuk
lima data dengan derajat bebas db = 3 yaitu sebesar 0,878 taraf kepercayaan 95. Data persamaan kurva baku yang diperoleh dari parasetamol dan natrium
fenobarbital dapat dilihat pada tabel-tabel berikut.
Tabel V. Data kurva baku parasetamol
Replikasi I Replikasi II
Replikasi III C
mgml AUC
C mgml
AUC C
mgml AUC
0,0704 0,1408
0,2112 0,2816
0,352 2104400
3945868 5711632
7613654 9308203
0,0701 0,1402
0,2104 0,2805
0,3506 2000887
3787538 5610533
7495138 8583764
0,0704 0,1408
0,2111 0,2815
0,3519 1928215
3708519 5286410
7387241 9252065
A B
r 314133,8
25675272,73 0,9998
A B
r 434227,73
24060393,01 0,9963
A B
r 13735,68
26043167,19 0,9990
Keterangan = merupakan data kurva baku parasetamol yang digunakan
Tabel VI. Data kurva baku natrium fenobarbital
Replikasi I Replikasi II
Replikasi III C
mgml AUC
C mgml
AUC C
mgml AUC
1,019 1,24
1,506 1,77
2,2144 2915335
3123870 3837280
4636561 5981528
1,013 1,233
1,498
1,76 2,2028
2554248 3372032
4211253 4892742
6047231 1,0166
1,24 1,503
1,77 2,21
2948199 3597697
3961215 4905167
6166657
A B
r -19515372
2657257,45 0,991
A B
r -253550,44
2899421,05 0,997
A B
r 172807,72
2676481,52 0,993
Keterangan = merupakan data kurva baku natrium fenobarbital yang digunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Berdasarkan hasil yang diperoleh pada tabel V, data kurva baku yang digunakan untuk parasetamol adalah replikasi I. Karena koefisien korelasi r yang
diperoleh merupakan yang paling tinggi dibanding replikasi yang lain. Kurva baku tersebut memenuhi persyaratan linearitas karena memiliki nilai r 0,99 Anonim
c
, 2004.
Berdasarkan tabel VI, data kurva baku yang digunakan untuk natrium fenobarbital adalah replikasi II. Karena koefisien korelasi r yang diperoleh juga
merupakan yang paling tinggi dibanding replikasi yang lain dan memenuhi persyaratan linearitas dengan nilai r 0,99 Anonim
c
, 2004. Dengan demikian persamaan kurva baku yang digunakan untuk analisis
kuantitatif parasetamol adalah y = 25675272,73 x + 314133,88 dan persamaan kurva baku yang digunakan untuk analisis kuantitatif natrium fenobarbital adalah y =
2899421,05 x – 253550,44. Analisis kuantitatif dilakukan pada sampel yang mengandung campuran
parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan 11 : 1 166,7 mg parasetamol dan 15 mg natrium fenobarbital. Perbandingan ini disesuaikan dengan
perbandingan parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel di Rumah Sakit X. Konsentrasi natrium fenobarbital dalam sampel adalah 1,5 mgml, sedangkan
konsentrasi parasetamol dalam sampel adalah 16,67 mgml. Karena perbedaan konsentrasi kedua senyawa yang sangat besar, maka
pada penelitian ini parasetamol dan asam fenobarbiturat tidak dapat diamati kromatogramnya secara bersamaan. Cara yang dilakukan adalah sampel tanpa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
pengenceran disuntikkan ke dalam kolom terlebih dahulu untuk mengamati kromatogram asam fenobarbiturat dengan attenuasi 7. Contoh kromatogram sampel
asam fenobarbiturat dapat dilihat pada gambar berikut.
Gambar 17. Kromatogram sampel asam fenobarbiturat replikasi 3
Pada kromatrogram tersebut asam fenobarbiturat memiliki waktu retensi 8,583 menit, waktu retensi ini sama dengan waktu retensi kromatogram asam
fenobarbiturat baku seperti terlihat pada tabel VII dengan demikian dapat dipastikan bahwa kromatogram tersebut adalah kromatogram asam fenobarbiturat .
Tabel VII. Data waktu retensi t
R
masing -masing senyawa baku dan sampel
Senyawa t
R
baku menit t
R
sampel menit Parasetamol
3,236 3,100
Asam fenobarbiturat 8,525
8,583
Pada gambar 17, terlihat bahwa kromatogram parasetamol tidak dapat terbaca karena peaknya terlalu tinggi. Maka untuk mendapatkan kromatogram
parasetamol dilakukan pengenceran sebanyak 80 kali terhadap sampel yang sama,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
sampai diperoleh parasetamol dengan konsentrasi 0,21 mgml, kemudian disuntikkan ke dalam kolom dengan attenuasi 9 menggunakan kondisi KCKT komposisi fase
gerak serta kecepatan alir yang sama dengan sampel sebelum diencerkan. Kromatogram parasetamol yang tampak setelah dilakukan pengenceran sampel dapat
dilihat pada gambar berikut.
Gambar 18. Kromatogram sampel parasetamol replikasi 3
Berdasarkan kromatogram tersebut waktu retensi kromatogram sampel parasetamol adalah 3, 100 menit, yang sama dengan waktu retensi parasetamol baku
sesuai dengan data pada tabel VII. Dengan demikian dapat dipastikan bahwa kromatogram tersebut benar-benar merupakan kromatogram parasetamol.
Selanjutnya analisis kuantitatif dilakukan dengan cara menghitung kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel menggunakan persamaan kurva
baku yang diperoleh. Dari 6 kali replikasi, hasil yang diperoleh adalah sebagai berikut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel VIII. Data kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel
Parasetamol Natrium fenobarbital
Sampel AUC
Kadar mgml AUC
Kadar mgml 1
2 3
4 5
6 5658262
5745480 5914806
5829954 5682401
5581771 16,65
16,92 17,45
17,18 16,73
16,42 4225605
4033752 4044411
3952644 4048479
4114875 1,55
1,48 1,48
1,45 1,48
1,51
X 16,89
X 1,49
SD 0,37
SD 0,034
KV 2,2
KV 2,3
Berdasarkan data tersebut, kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel secara berturut-turut adalah 16,89+0,37 mgml dan 1,49+0,034
mgml. Kesahihan hasil yang diperoleh tersebut dapat diketahui dengan melakukan validasi metode penetapan kadar.
F. Validasi Metode Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium
