Gambar 10. Gabungan spektrum serapan parasetamol A konsentrasi 0,009 mgml dan natrium fenobarbital B konsentrasi 0,09 mgml
Pada gambar 10 dapat terlihat bahwa pada perbandingan 1:10 natrium fenobarbital baru dapat memberikan absorbansi yang mirip dengan parasetamol.
Sehingga berdasarkan spektrum tumpang tindih tersebut, panjang gelombang pengamatan yang dipilih adalah 236 nm yang merupakan panjang gelombang
serapan maksimum dari natrium fenobarbital. Panjang gelombang ini dipilih supaya natrium fenobarbital dapat terdeteksi karena absorbansi natrium fenobarbital sangat
kecil dibandingkan parasetamol. Selain itu pada gambar 10 dapat terlihat juga bahwa parasetamol dapat memberikan absorbansi pada panjang gelombang 236 nm.
D. Optimasi Pemisahan Parasetamol dan Natrium Fenobarbital dengan
KCKT Fase Terbalik
Campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dipisahkan dengan KCKT jenis kromatografi partisi fase terbalik. Fase diam yang digunakan adalah
oktadesilsilan C
18
yang bersifat nonpolar, sedangkan fase gerak yang digunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
adalah campuran metanol dan buffer fosfat pH 3,2 yang bersifat polar. Dengan demikian, sampel yang bersifat lebih polar akan terelusi lebih dulu sedangkan sampel
yang lebih nonpolar akan terelusi belakangan karena tertambat pada fase diam Willard dkk, 1988.
Pada kromatografi fase terbalik, ionisasi analit harus diminimalkan supaya analit tidak terlalu polar dan tetap dapat berinteraksi dengan fase diam oktadesilsilan
C
18
yang bersifat nonpolar. Maka pada penelitian ini digunakan buffer asam sebagai pelarut dan fase gerak, untuk mengubah garam natrium fenobarbital menjadi bentuk
asamnya, supaya tidak mengalami ionisasi dan dapat berinteraksi dengan fase diam. Apabila digunakan aquabidest sebagai fase gerak, garam natrium fenobarbital akan
larut dan berubah menjadi spesies ion yang tidak dapat berinteraksi dengan fase diam akibatnya kromatogram natrium fenobarbital tidak dapat diamati.
Dengan demikian untuk selanjutnya natrium fenobarbital akan disebut sebagai asam fenobarbiturat dalam penelitian ini, kecuali dalam perhitungan kurva
baku dan sampel. Reaksi antara buffer fosfat pH 3,2 dengan natrium fenobarbital, membentuk asam fenobarbiturat fenobarbital adalah sebagai berikut.
+
NH H
N O
Na
O O
C
2
H
5
NH H
N O
H
O O
C
2
H
5
+
natrium fenobarbital asam fenobarbiturat
P
O HO
OH
OH
P
O HO
OH
O Na
asam fosfat natrium dihidroksi fosfat
Gambar 11. Reaksi antara natrium fenobarbital dengan asam fosfat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pemisahan pada KCKT dipengaruhi oleh interaksi suatu analit dengan fase diam dan fase gerak. Parasetamol dan asam fenobarbiturat yang terbentuk memiliki
gugus polar dan nonpolar. Gugus polar akan berinteraksi dengan fase gerak melalui ikatan hidrogen, sedangkan gugus nonpolar akan berinteraksi dengan fase diam
oktadesilsilan melalui ikatan van der Waals. Gambar gugus nonpolar dari parasetamol dan asam fenobarbiturat yang akan membentuk ikatan van der Waals
dengan fase diam adalah sebagai berikut.
HO H
N C
O CH
3
NH H
N O
O O
C
2
H
5
A B
Gambar 12. Gugus nonpolar dari parasetamol A dan asam fenobarbiturat B yang berinteraksi dengan fase diam
Keterangan : = gugus nonpolar
Pada gambar di atas dapat terlihat bahwa asam fenobarbiturat memiliki gugus nonpolar yang lebih banyak dibanding parasetamol. Dengan demikian asam
fenobarbiturat akan lebih tertahan pada fase diam dibandingkan parasetamol, sehingga waktu retensinya lebih lama. Waktu retensi t
R
merupakan waktu yang dibutuhkan suatu senyawa untuk keluar dari kolom.
Perbandingan fase gerak campuran metanol dan buffer fosfat pH 3,2, maupun kecepatan alirnya harus dioptimasi terlebih dahulu untuk memperoleh
pemisahan parasetamol dan asam fenobarbiturat yang optimum. Seperti yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
disebutkan sebelumnya, pada penelitian ini perbandingan fase gerak buffer fosfat pH 3,2 : metanol yang dioptimasi adalah 90 : 10 dan 70 : 30, sedangkan kecepatan alir
yang dioptimasi adalah 1 dan 1,5 mlmenit. Komposisi fase gerak dan kecepatan alir yang optimum ditentukan dari
resolusi kromatogram yang dihasilkan. Resolusi merupakan suatu pemisahan yang nyata antara dua kromatogram yang berdekatan. Suatu pemisahan yang baik
memiliki resolusi yang lebih dari atau sama dengan 1,5, berarti terjadi pemisahan antara kedua senyawa 99,7 Sastrohamidjojo
a
, 2002. Kromatogram parasetamol dan asam fenobarbiturat yang diperoleh dapat dilihat pada gambar berikut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 13. Puncak parasetamol a dan asam fenobarbiturat b Keterangan : Fase gerak buffer fosfat pH 3,2 : metanol 70 : 30
Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1 mlmenit
Deteksi UV 236 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 14. Puncak parasetamol a dan asam fenobarbiturat b Keterangan : Fase gerak buffer fosfat pH 3,2 : metanol 70 : 30
Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1,5 mlmenit
Deteksi UV 236 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 15. Puncak parasetamol a dan asam fenobarbiturat b Keterangan : Fase gerak buffer fosfat pH 3,2 : metanol 90 : 10
Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1 mlmenit
Deteksi UV 236 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 16. Puncak parasetamol a dan asam fenobarbiturat b Keterangan : Fase gerak buffer fosfat pH 3,2 : metanol 90 : 10
Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1,5 mlmenit
Deteksi UV 236 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Berdasarkan kromatogram optimasi pemisahan tersebut, terlihat bahwa peak parasetamol mengalami tailing yang disebabkan karena parasetamol memiliki gugus
amin yang akan berinteraksi dengan gugus silanol di dalam kolom. Adanya interaksi ini dapat menyebabkan pengekoran pada kurva parasetamol, karena sebagian analit
terlambat keluar dari kolom. Tailing juga terjadi pada kromatogram asam fenobarbiturat karena asam fenobarbiturat juga memiliki gugus amin. Tailing juga
dapat terjadi karena parasetamol dan asam fenobarbiturat memiliki kelarutan rendah
dalam fase gerak yang sebagian besar komposisinya adalah buffer fosfat pH 3,2. Hal ini menyebabkan analit yang sama-sama memiliki gugus nonpolar tertahan pada
kolom lebih lama, baru kemudian larut pada fase gerak sedikit demi sedikit sehingga menyebabkan pengekoran kromatogram. Sedangkan munculnya double peak pada
kromatogram parasetamol dan natrium fenobarbital disebabkan karena pelarut yang digunakan buffer fosfat pH 3,2:metanol 70:30 memiliki kekuatan ionik yang lebih
besar dibandingkan fase gerak buffer fosfat pH 3,2:metanol 90:10. Resolusi kromatogram parasetamol dan asam fenobarbiturat
yang diperoleh dapat dilihat pada tabel berikut.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Tabel IV. Resolusi pemisahan parasetamol 0,21 mgml dan asam fenobarbiturat 1,5 mgml pada KCKT
Buffer fosfat pH 3,2 :
metanol
Kecepatan alir mlmenit
Rep Resolusi
Keterangan
1 0,35
2 0,32
3 0,37
X 0,35
1
SD 0,03
Tidak memisah
1 0,28
2 0,3
3 0,33
X 0,30
70 : 30
1,5
SD 0,03
Tidak memisah
1 1,79
2 1,63
3 1,56
X 1,66
1
SD 0,12
Memisah
1 1,7
2 1,65
3 1,55
X 1,63
90 : 10
1,5
SD 0,08
Memisah
Berdasarkan data yang diperoleh, komposisi buffer fosfat pH 3,2 : metanol yang dipilih adalah komposisi 90 : 10 karena dapat memisahkan kromatogram
parasetamol dan asam fenobarbiturat dengan resolusi yang baik sedangkan pada
komposisi 70 : 30 parasetamol dan asam fenobarbiturat tidak dapat memisah.
Komposisi fase gerak 90 : 10 mengandung lebih banyak buffer fosfat pH 3,2, sehingga lebih banyak menyumbangkan ion H
+
yang diperlukan untuk membentuk asam fenobarbiturat. Pada komposisi fase gerak 70 : 30 asam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
fenobarbiturat memiliki waktu retensi yang lebih cepat, karena sebagian analit kemungkinan masih berada dalam bentuk garam ion yang lebih menyukai fase
gerak, sehingga menyebabkan pemisahannya dengan parasetamol tidak sempurna. Berdasarkan tabel IV, pada komposisi fase gerak 90 : 10, kedua kecepatan
alir yang dioptimasi memberikan hasil yang memenuhi persyaratan resolusi 1,5. Akan tetapi kecepatan alir yang dipilih adalah 1,5 mlmenit. Alasan pemilihan ini
adalah karena kecepatan alir 1,5 mlmenit memiliki tingkat reprodusibilitas yang lebih baik daripada kecepatan alir 1 mlmenit, hal ini terlihat pada besarnya standar
deviasi dari resolusi yang dihasilkan dari tiga kali replikasi. Selain itu, waktu retensi asam fenobarbiturat
lebih pendek pada kecepatan alir 1,5 mlmenit dibanding kecepatan alir 1 mlmenit karena adanya tekanan yang lebih besar pada kolom. Hal
ini sangat penting untuk efisiensi waktu kerja dalam analisis. Dengan demikian, selanjutnya analisis campuran parasetamol dan natrium
fenobarbital dengan metode KCKT menggunakan fase gerak metanol : buffer fosfat pH 3,2 dengan perbandingan 90 : 10 dan kecepatan alir 1,5 mlmenit.
E. Optimasi Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium Fenobarbital
