Uji Bioautografi Non Elusi Ekstrak

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.5.3 Peremajaan Bakteri

Bakteri uji diremajakan menggunakan medium Nutrient Agar NA. Proses peremajan bakteri bertujuan untuk meregenerasi bakteri uji yang digunakan sehingga diperoleh bakteri uji yang masih segar dan baru. Peremajaan dilakukan dengan proses inokulasi bakteri pada media miring yang cocok seperti NA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Tujuan dilakukan inkubasi adalah untuk mengkondisikan lingkungan yang optimum untuk pertumbuhan bakteri.

4.5.4 Pembuatan Suspensi Bakteri

Pembuatan suspensi bakteri mengacu pada Valgas, C. et al. 2007 dan Ismail, S. et al. 2011. Suspensi bakteri dibuat pada medium medium Brain Heart Infussion BHI broth dengan kekeruhan 10 6 CFUmL.

4.5.5 Uji Bioautografi Non Elusi Ekstrak

Tahap uji antibakteri yang pertama adalah skrining aktivitas antibakteri ekstrak dengan metode bioautografi langsung non elusi TLC-DB dot-blot test Choma, Irena M. and Wioleta Jesionek, 2015. Skrining ini bertujuan untuk menentukan ekstrak yang memiliki aktivitas antibakteri tertinggi senyawa bioaktif dan selanjutnya akan dilakukan kromatografi kolom. Aktivitas antibakteri ditentukan dari besarnya diameter zona hambat yang terbentuk. Biautografi langsung yang digunakan merupakan bioautografi langsung konversional. Metode ini cocok untuk deteksi antibiotik atau antijamur, namun tidak cocok untuk mempelajari dan memahami semua reaksi biokimia rumit yang terlibat. Disamping untuk mencari senyawa bioaktif, bioautografi langsung dapat untuk menemukan pelarut yang terbaik untuk ekstraksi senyawa aktif, dan pemilihan fase gerak dengan pemisahan yang cocok Choma, Irena, 2013. Masing-masing ekstrak uji dibuat dengan konsentrasi 5 mgmL 5 mgmL – 40 mgmL dan dilarutkan pada masing-masing pelarut yang digunakan untuk ekstraksi Valgas, C. et al., 2007. Kontrol positif digunakan kloramfenikol 30 �gmL untuk bakteri Staphylococcus aureus dan 200 �gmL untuk bakteri Salmonella enterica sv typhimurium. Konsentrasi kloramfenikol yang digunakan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta terhadap bakteri Salmonella enterica sv typhimurium lebih besar daripada konsentrasi yang digunakan terhadap bakteri Stapylococcuc aureus. Hal ini dimungkinkan karena bakteri Salmonella enteric sv typhimurium telah mengalami resistensi terhadap kloramfenikol. Sebanyak 10 �L masing-masing ekstrak uji ekstrak n-heksana ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol, kontrol positif kloramfenikol, dan kontrol negatif n-heksan, etil asetat, metanol, dan DMSO 10 ditotolkan pada plat KLT ukuran 6 cm × 4 cm yang telah disiapkan Ismail, S. et al., 2011. Sisa pelarut pada saat penotolan dibiarkan menguap. Plat KLT dicelupkan ke dalam suspensi bakteri selama ± 5 detik dan dipindahkan ke dalam cawan petri steril yang terdapat kapas yang telah dibasahi dengan aquadest steril Jesionek, W. et al., 2014. Kapas tersebut berguna sebagai penyangga dan adanya aquadest dapat menjaga kelembaban udara di dalam cawan petri Sudirman, L. I., 2005. Plat diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah itu, Plat KLT disemprotkan reagen INT untuk visualisasi aktivitas antibakteri yang diberikan oleh sampel uji. Plat diinkubasi kembali pada suhu 37 C selama 4 jam dan diamati setiap jamnya Valgas, C. et al., 2007. Reagen INT akan berinteraksi dengan bakteri, enzim dehidrogenase dari bakteri akan mengubah INT menjadi formazan berwarna ungu untuk menandakan bahwa daerah tersebut terdapat pertumbuhan bakteri. Adanya zona bening yang terbentuk dengan latar belakang berwarna ungu menandakan adanya aktivitas antibakteri Dewanjee, Saikat et al., 2015. Zona bening yang terbentuk diukur menggunakan jangka sorong untuk mengetahui diameter zona hambat. Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri tertinggi dengan zona hambat terbesar yaitu 4,98 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan 7,4 mm terhadap Salmonella enterica sv typhimurium Tabel 4.4; Gambar 4.2. Ekstrak etil asetat merupakan ekstrak yang digunakan untuk tahap selanjutnya yaitu kromatografi kolom. Ekstrak ini dipilih karena mempunyai aktivitas antibakteri paling besar jika dibandingkan dengan ekstrak n-heksana dan ekstrak metanol. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta a b Keterangan: 1. NH = Ekstrak n-heksana 2. EA = Ekstrak etil asetat 3. M = Ekstrak metanol 4. NH- = Kontrol negatif n-heksana 5. EA- = Kontrol negatif etil asetat 6. M- = Kontrol negatif metanol 7. C+ = Kontrol positif kloramfenikol Gambar 4.2 Hasil Uji Bioautografi Non Elusi Ekstrak n-Heksana, Ekstrak Etil Asetat, dan Ekstrak Metanol dari Daun Garcinia benthami Pierre; a terhadap bakteri Staphylococcus aureus b terhadap bakteri Salmonella enterica sv typhimurium. Tabel 4.4 Diameter Zona Hambat Ekstrak n-Heksana, Etil Asetat, dan Metanol Garcinia benthami Pierre TLC-BD dot-blot test Bioautografi Non Elusi Bakteri Uji Sampel Konsentrasi �gmL Rata-Rata Diameter Zona Hambat mm Staphylococcus aureus Ekstrak n-Heksana 5000 4,2 Ekstrak Etil Asetat 4,98 Ekstrak Metanol 4,3 K+; Kloramfenikol 30 20,8 K-; n-Heksana - - K-; Etil Asetat - - K-; Metanol - - Salmonella enterica sv typhimurium Ekstrak n-Heksana 5000 1,5 Ekstrak Etil Asetat 7,4 Ekstrak Metanol 4,54 K+; Kloramfenikol 200 18,45 K-; n-Heksana - - K-; Etil Asetat - - K-; Metanol - - Keterangan: - tidak ada zona hambat; K+ kontrol positif; K- kontrol negatif NH M NH- EA- EA M- C+ NH M NH- EA- EA M- C+ UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.6 Isolasi dengan Kromatografi Kolom