UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gel 60 F
254
. Untuk uji bioautografi non elusi ekstrak dan fraksi, ukuran plat yang digunakan 6 cm × 4 cm dengan jarak antara penotolan satu dengan
lainnya adalah 2 cm. Ukuran plat KLT yang digunakan dapat menyesuaikan dengan ukuran cawan petri yang digunakan. Untuk uji bioautografi elusi fraksi
teraktif, ukuran plat yang digunakan 2 cm × 6 cm.
3.3.6.9 Penentuan Ekstrak dengan Diameter Zona Hambat Terbesar
Penentuan ekstrak dengan diameter zona hambat terbesar adalah dengan metode bioautografi langsung non elusi atau TLC-BD Thin Layer
Chromatography – Bioautography Direct dot-blot Choma, Irena M. and
Wioleta Jesionek, 2015. Plat KLT yang telah disiapkan ditotoli dengan 10 �L
ekstrak uji 5 mgmL ekstrak n-heksana, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol, kontrol positif kloramfenikol 30
�gmL untuk bakteri Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan kloramfenikol 200
�gmL, dan kontrol negatif pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol. Plat dibiarkan
beberapa menit hingga pelarutnya menguap. Plat dicelupkan ke dalam suspensi bakteri uji 10
6
CFUmL selama ± 5 detik. Plat diletakkan ke dalam cawan petri steril yang didalamnya terdapat kapas yang telah dibasahi dengan aquadest
steril dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah itu, plat disemprot
dengan reagen p-iodonitrotetrazolium violet INT 2 mgmL dan diinkubasi kembali selama 4 jam dan diamati setiap jamnya. Diameter zona hambat diukur
menggunakan jangka sorong Valgas, C. et al., 2007; Ismail, S. et al., 2011. Hal sama juga dilakukan pada semua fraksi yang diperoleh dari kromatografi
kolom dan pengujian dilakukan triplo.
3.3.7 Isolasi dengan Kromatografi Kolom
3.3.7.1 Penyiapan Sampel
Berdasarkan uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi langsung, ekstrak etil asetat memiliki aktivitas antibakteri tertinggi. Sebanyak 20 gram
ekstrak etil asetat dari daun Garcinia benthami Pierre, diadsorpsi menggunakan silica gel 60 0,063-0,200 mm for column chromatography sebanyak 15 gram
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sedikit demi sedikit dengan cara diaduk dengan lumpang alu hingga diperoleh sampel yang dapat mengalir seperti serbuk.
3.3.7.2 Penyiapan Kolom Kromatografi
Kolom kromatografi yang digunakan memiliki ukuran tinggi 100 cm dan diameter 2 cm. Bagian dasar kolom disumbat menggunakan kapas. Kolom dialiri
dengan pelarut n-heksana dan kapas ditekan-tekan dengan batang pengaduk hingga tidak ada udara yang terjerap. Dibuat bubur silika dengan menimbang
serbuk silika gel sebanyak 100 gram dan didispersikan dengan pelarut n-heksana menjadi bubur silika. Bubur silika gel dimasukkan ke dalam kromatografi kolom
dan kolom dialiri dengan menggunakan pelarut n-heksana. Pelarut yang mengalir ditampung dan dimasukkan kembali ke dalam kolom. Proses ini
dilakukan berulang-ulang sambil dinding kolom diketuk-ketuk dengan batang karet hingga silika memadat. Ekstrak hasil preadsorpsi dengan silika gel dan
dimasukkan ke dalam kolom.
3.3.7.3 Proses Fraksinasi
Pada proses fraksinasi fase gerak yang digunakan adalah sistem gradient n-heksana:etil asetat berdasakan penelitian Komala, I. et al., 2010, setiap
gradient kepolarannya ditingkatkan 10. Fraksinasi pertama dilakukan dengan mengaliri kolom menggunakan fase gerak n-heksana 100. Eluat yang menetes,
ditampung dalam vial yang sebelumnya telah diberi nomor. Penggantian gradient fase gerak dilakukan ketika gradient sebelumnya telah habis digunakan
untuk mengaliri kolom. Fraksinasi dilakukan hingga fase gerak yang digunakan telah mencapai gradient akhir yaitu etil asetat 100. Setiap eluen dibuat dengan
volume 1200 mL. Semua fraksi yang diperoleh diuapkan terlebih dahulu dengan cara diangin-anginkan. Kemudian dilakukan kromatografi lapis tipis KLT dan
dilihat pola bercak yang dihasilkan dibawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Fraksi dengan memberikan pola bercak dengan
Rf yang sama digabungkan menjadi satu dan diuji aktivitas antibakteri
menggunakan metode bioautografi langsung.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.8 Pemurnian
