UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
suhu dingin yang menyebabkan uap ini mengembun dan akhirnya jatuh ke tabung penerima receiver flask.
2.3.3 Metode Isolasi
2.3.3.1 Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia, Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam
tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat CaCO
3
Ganjar Rohman, 2007. Kromatografi merupakan metode pemisahan fisikokimia untuk memisahkan campuran
senyawa berdasarkan perbedaan waktu huni komponen campuran dalam sistem fase diam dan fase gerak Hostettman, et al., 1995.
Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase, yaitu fase diam stationer dan fase gerak mobile. Fase diam bertindak sebagai zat
penjerap seperti alumina, silika gel, dan resin penukar ion atau bertindak melarutkan zat terlarut seperti pada kromatografi kertas. Fase gerak membawa
zat terlarut melalui fase diam dengan kecepatan tergantung pada daya ikat setiap zat terlarut terhadap kedua fase. Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya
distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase gerak berdasarkan sifat fisik komponen yang akan dipisahkan Harbone, 1996.
2.3.3.2 Kromatografi Lapis tipis
Kromatografi lapis tipis KLT merupakan salah satu metode pilihan kromatografi secara fisikokimia Gandjar Rohman, 2007. KLT merupakan
bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam uniform pada permukaan
bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat alumunium atau plat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini merupakan bentuk terbuka
dari kromatografi kolom Gritter, et al., 1991. KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai untuk mencapai
hasil kualitatif, kuantitatif atau preparatif. Kedua dipakai untuk menjajaki sistem
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom Gritter, et al., 1991.
Kromatografi lapis tipis KLT dapat digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif. KLT analitik digunakan untuk menganalisa senyawa-senyawa
organik dalam jumlah kecil misalnya, menentukan jumlah komponen dalam campuran dan menentukan pelarut yang tepat untuk pemisahan dengan KLT
preparatif. Sedangkan KLT preparatif digunakan untuk memisahkan campuran senyawa dari sampel dalam jumlah besar berdasarkan fraksinya, yang
selanjutnya fraksi-fraksi tersebut dikumpulkan dan digunakan untuk analisa berikutnya Townshend, 1995.
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang atau cairan pengelusi akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan
secara mekanik ascending, atau karena pengaruh grafitasi pada pengembang menurun descending Gritter, et al., 1991.
Jumlah volume fase gerak harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan. Setelah lempeng terelusi, dilakukan
deteksi bercak. Laju pergerakan fase gerak terhadap fase diam dihitung sebagai retardation farctor Rf. Nilai Rf diperoleh dengan membandingkan jarak yang
ditempuh oleh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak Gandjar Rohman, 2007.
Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi. Hal ini dikarenakan KLT merupakan teknik yang sensitif. Fase gerak yang digunakan adalah pelarut
organik yang memiliki tingkat polaritas tersendiri, melarutkan senyawa contoh, dan tidak bereaksi dengan penjerap Gritter, et al., 1991.
a. Fase Diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 mikrometer. Penjerap yang paling
sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi utama pada KLT adalah partisi dan adsorpsi Ganjar Rohman,
2007. Adsorben umum yang digunakan dalam KLT meliputi partikel silika
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
gel ukuran 12 µm, alumina, mineral oksida, silikagel dengan ikatan kimia, selulosa, poliamida, polimer penukar ion, silikagel, danfase kiral Gocan,
2002.
Tabel 2.1 Fase Diam Kromatografi Lapis Tipis
Penjerap Mekanisme sorbsi
Penggunaan
Silika gel Adsorpsi
Asam amino, hidrokarbon, vitamin, alkaloid.
Silika yang dimodifikasi dengan
hidrokarbon Partisi
termodifikasi Senyawa-senyawa non polar
Serbuk selulosa Partisi
Asam amino, nukleotida, karnohidrat.
Alumina Adsorpsi
Hidrokarbon, ion logam, pewarna makanan, alkaloid.
Kieselguhr tanah diatomae
Partisi Gula, asam-asam lemak.
Selulosa penukar ion Pertukaran ion
Asam nukleat, nukleotida, halida dan ion-ion logam.
Gel sephadex Eksklusi
Polimer, protein, kompleks logam.
�-siklodekstrin Interaksi adsorpsi
stereospesifik Campuran enansiomer.
b. Fase Gerak
Pada kromatografi KLT umumnya fase gerak yang digunakan adalah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini
dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Adapun petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase
gerak Ganjar Rohman, 2007: -
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
- Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan. -
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang
berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
- Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia
masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam.
c. Penotolan Sampel
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin.
Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Untuk
memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 mikroliter. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10
mikroliter maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan. Penotolan yang tidak tepat akan
menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda Ganjar Rohman, 2007.
d. Pengembangan
Bila sampel
telah ditotolkan
maka tahap
selanjutnya adalah
mengembangkan sampel tersebut dalam suatu bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhkan dengan fase gerak. Tepi bagian bawah
lempeng lapis tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke dalam bejana berisi fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana
harus di bawah lempeng. Ada beberapa teknik untuk pengembangan dalam kromatografi lapis tipis, yaitu pengembangan menaik ascending, menurun
descending, melingkar dan mendatar Ganjar Rohman, 2007.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
e. Deteksi Bercak
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, dan
biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi
jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi
sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluoresensi
maka bahan penyerapnya akan diberi indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan hitam sedang latar belakangnya akan
kelihatan berfluoresensi Ganjar Rohman, 2007.
2.3.3.3 Identifikasi Kromatogram
