positif ditunjukan dengan terbentuknya endapan jingga pada larutan yang ditambahkan pereaksi Dragendorff dan endapan putih hingga kekuningan pada
larutan yang ditambahkan pereaksi Mayer Jones dan Kinghorn, 2006. g.
Uji terpenoid Larutan uji sebanyak 2,5 ml dicampur dengan 1 ml kloroform kemudian
ditambahkan 1,5 ml H
2
SO
4
pekat secara hati-hati melewati dinding tabung. Hasil positif adanya senyawa terpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya cincin warna
coklat kemerahan pada permukaaan dalam larutan Edeoga, Okwu, dan Mbaebre, 2005.
h. Uji saponin
Sebanyak 100 mg serbuk bunga petai ditambahkan 10 mL aquadest ke dalam tabung reaksi, ditutup dan dikocok kuat-kuat selama 30 detik. Tabung
dibiarkan dalam posisi tegak. Apabila terbentuk buih setinggi kurang lebih 1-10 cm selama ± 10 menit pada permukaan cairan dan setelah penambahan ± 1 tetes
HCl 2 N busa tidak hilang, maka menujukkan adanya senyawa saponin Departemen Kesehataan RI, 1995.
7. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol bunga petai terhadap S. aureus dan E.
coli
a. Sterilisasi alat dan bahan
Seluruh alat gelas laboratorium yang akan digunakan untuk pengujian aktivitas anitbakteri dicuci dengan sabun dan dikeringkan. Alat-alat gelas
dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian dibungkus dengan kertas. Semua alat yang telah dibungkus dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 30 menit. Jarum ose disterilkan dengan memijarkan pada api bunsen, dan tabung
mikropipet disterilkan dengan direndam pada alkohol. b.
Pembuatan pelarut ekstrak Pelarut yang akan digunakan yaitu DMSO konsentrasi 5 vv.
Pembuatan DMSO 5 dilakukan dengan cara melarutkan 5 ml DMSO, kemudian di tambahkan dengan aquadest sampai 100 mL.
c.
Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji
Ekstrak etanol bunga petai untuk uji potensi antibakteri menggunakan 5 seri konsentrasi. Konsentrasi 50 didapatkan dengan melarutkan 3 gram ekstrak
kental dengan 6 mL DMSO 5, kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi 25; 12,5; 6,25; 3,125. Kontrol negatif digunakan
DMSO 5 dan sebagai kontrol positif digunakan amoksisilin 125mg5ml. Tabel I. Pembuatan Variasi Konsentrasi Uji.
Konsentrasi larutan uji Volume yang diambil
dari stok larutan ujimL Volume DMSO yang
ditambahakan mL 25
2 4
12,5 2
4 6,25
2 4
3,125 2
4 d.
Identifikasi bakteri uji 1
Staphylococcus aureus
Bakteri diinokulasi di media geolitik, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Bila terdapat endapan hitam pada media geolitik diduga bakteri tersebut merupakan Staphylococcus. Bakteri diisolasi dari media geolitik ke media Enrich,
diinkubasi selama 2 X 24 jam pada suhu 37
o
C. Jika terdapat kabut putih diduga bakteri Staphylococcus. Kemudian, diambil 1-2 ose bakteri, diinokulasikan ke media
gula glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sakarosa, media Simons Citrat SC, media Sulfur Indol Motil SIM dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Tahap selanjutnya dilakukan uji koagulase dan pengecatan Gram.
2 Escherichia coli
Bakteri diinokulasi di media penyubur Brilliant Green Lactose Blue BGLD, kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37
o
C. Jika terdapat koloni berwarna biru diduga bakteri Escherichia. Tahap selanjutnya, bakteri diisolasi lalu
ditanam ke media TBX Tryptone Bile X-Glucoronide dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Pada media isolasi setelah 24 jam diduga adanya Escherichia coli
dengan timbulnya warna hijau, kemudian bakteri diambil 1-2 ose, diinokulasi ke dalam media gula glukosa, sakarosa, laktosa, maltose, manitol, SC Simon Citrat,
SIM Sulfur Indol Motil dan diinkubasi selama 24 jam. Tahap selanjutnya dilakukan pengecatan Gram.
e. Pembuatan stok bakteri uji
Bakteri diambil sebanyak 1-2 ose dari kultur murni mikroba simpanan, diinokulasikan ke 5 mL MHA dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
f. Pembuatan suspensi bakteri uji
Bakteri diambil sebanyak 1-3 ose dari stok kultur mikroba, kemudian diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi MHB dan divortex agar
tercampur merata. Suspensi bakteri yang telah dibuat disetarakan kekeruhanya dengan larutan Mac Farland 0,5 1,5 X 10
8
CFU. g.
Uji aktivitas antibakteri ekstrak bunga petai dengan metode difusi sumuran. Inokulasi bakteri uji dilakukan dengan menggunakan metode Kirby
Bauer . Bakteri uji S. aureus dan E. coli diinokulasikan dengan cara diusap secara
merata pada media 20 mL MHA yang telah memadat pada petri. Setelah bakteri diinokulasikan, dibuat sumuran dengan menggunakan pelubang sumuran
berdiameter 6 mm sebanyak 5 buah lubang sumuran. Kelima lubang sumuran diisi dengan konsentrasi ekstrak etanol bunga petai, sedangkan lubang sumuran
yang akan diisi kontrol positif dan negatif dibuat dalam satu petri yang sama tetapi berbeda petri dengan perlakuan konsentrasi ekstrak. Tiap lubang sumuran
pada media yang telah diinokulasikan bakteri uji diisi dengan 50 µL senyawa uji yang terdiri dari amoksisilin 125 mg5 ml sebagai kontrol positif dan DMSO 5
sebagai kontrol negatif. Lubang sumuran pada petri lainnya yang telah diinokulasi bakteri uji, diisi 50 µL ekstrak etanol bunga petai dengan konsentrasi
50; 25; 12,5; 6,25 dan 3,125. Semua petri yang telah berisi bakteri uji dan senyawa uji pada tiap lubang sumuran diinkubasi selama 24 jam pada suhu
37
o
C selanjutnya diamati ada atau tidaknya zona jernih disekitar sumuran. Zona jernih yang tampak diukur dengan penggaris.
8. Penentuan KHM dan KBM dengan metode dilusi cair
