Uji identifikasi bakteri lainnya yaitu pewarnaan Gram, kemudian diamati dengan mikroskop. Menurut Brooks dkk., 2010 S.aureus pada pemeriksaan
mikroskopik berbentuk kokus dan menghasilkan warna ungu pada pewarnaan Gram sedangkan E.coli berbentuk batang pada pemeriksaan mikroskopik dan pada
pewarnaan Gram berwarna merah. Hasil penelitan yang diperoleh yaitu S.aureus berbentuk berbentuk kokus dan menghasilkan warna ungu pada pewarnaan Gram
sedangkan pada E.coli berbentuk batang dan berwarna merah pada pewarnaan Gram Lampiran 6
. Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini menujukkan hasil yang
sesuai dengan pustaka Brooks dkk., 2010. Berdasarkan hasil uji identifikasi yang diperoleh menunjukkan bahwa bakteri uji yang digunakan merupakan S.aureus dan
E.coli .
4. Pembuatan stok bakteri dan suspensi bakteri uji
Stok bakteri uji yang dibuat berasal dari kultur murni. Pembuatan stok dilakukan untuk memenuhi agar suplai nutrisi untuk bakteri dari media selalu tetap
tersedia sehingga bakteri tidak mati dan tetap tumbuh subur. Tahap selanjutnya yaitu pembuatan suspensi bakteri uji. Suspensi bakteri uji yang telah dibuat disetarakan
kekeruhan dengan larutan Mac Farland 0,5 menggunakan alat nephelometer. Berdasarkan Cockerill, Mathew, Alder, Dudley, Eliopoulos, Ferraro dkk., 2012
penyetaraan kekeruhan suspensi bakteri uji untuk uji kepekaan antimikroba disetarakan dengan menggunakan Mac Farland 0,5. Penyetaraan melalui kekeruhan
bertujuan agar jumlah bakteri yang akan digunakan untuk perlakuan tiap konsetrasi dan replikasi yang digunakan tetap sama.
5. Uji aktivitas antibakteri ekstrak bunga petai dengan metode difusi sumuran
Uji aktivitas antibakteri ekstrak bunga petai terhadap S.aureus dan E.coli dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumuran. Prinsip metode difusi
sumuran yaitu ekstrak bunga petai akan berdifusi ke dalam media pada yang telah diinokulasikan bakteri uji, sehingga ekstrak bunga petai akan menghambat
pertumbuhan bakteri atau membunuh bakteri uji yang ditunjukkan dengan paramater zona hambat disekitar lubang sumuran setelah diinkubasi selama 24 jam., pada suhu
37
o
C. Pada pengujian ini dibuat 4 kontrol yaitu kontrol kontaminasi media, kontrol
pertumbuhan bakteri uji, kontrol negatif DMSO dan kontrol positif Amoksisilin. Kontrol kontaminasi media bertujuan untuk melihat keaseptisan selama proses kerja,
sehingga dapat diketahui ada atau tidak adanya kontaminasi pertumbuhan mikroorganisme lain selama proses pengujian. Kontrol pertumbuhan bakteri uji
bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri uji pada media tanpa perlakuan, sehingga diketahui apakah bakteri dapat tumbuh baik pada media yang digunakan
atau tidak. Kontrol negatif atau kontrol pelarut bertujuan untuk melihat apakah pelarut mempunyai aktivitas sebagai antibakteri yang nantinya dapat menyebabkan
bias hasil penelitian. Kontrol positif digunakan sebagai kontrol metode yang bertujuan untuk memastikan metode yang dilakukan sudah benar atau belum yang
ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat. Kontrol positif juga membantu melihat wujud adanya aktivitas penghambatan bakteri. Data diameter zona hambat
yang diperoleh disajikan dalam tabel IV. Tabel IV. Diameter Zona Hambat Seri Konsentasi Ekstrak Etanol Bunga Petai,
Kontrol Positif dan Negatif terhadap S.aureus dan E. coli. Perlakuan
Diameter zona hambat S.aureus
mm Diameter zona hambat
E. coli. mm I
II III
Rerata .I
II III
Rerata Kontrol
positif 36
34,33 35
35,11 28
27 33
29,33 Kontrol
negatif Konsentrasi
50 11,67
14 11,33
12,33 Konsentrasi
25 9
10 10,67
9,89 Konsentrasi
12,5 7,33
8 9
8,11 Konsentrasi
6,25 6
5 3,67
Konsentrasi 3,125
4,33 1,44
Diameter zona hambat sudah dikurangi diameter sumuran 6 mm Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol bunga petai menunjukkan bahwa
amoksisilin yang digunakan sebagai kontrol positif benar-benar memiliki kemampuan sebagai antibakteri yang ditunjukkan dengan adanya diameter zona jernih.
Amoksisilin merupakan antibiotik golongan beta laktam yang memiliki spektrum kerja yang luas dan efektif untuk melawan infeksi yang disebabkan oleh Gram negatif
dan positif. Menurut Rehm, Sekeres, dan Neuner 2012 mekanisme kerja amoksisilin yaitu dengan menghambat enzim transpeptidase sehingga menghambat struktur ikatan
silang dalam biosintesis peptidoglikan pada dinding bakteri sehingga menyebabkan
kematian sel bakteri. Amoksisilin cukup lipofilik untuk menembus porin membran bakteri Gram negatif, selain itu adanya rantai samping yang bersifat polar dari
struktur amoksisilin dapat menembus membran bakteri gram positif Brooks dkk., 2009. Hasil yang diperoleh pada kontrol negatif DMSO 5 tidak menunjukkan
zona hambat disekitar sumuran. Hal ini menujukkan bahwa DMSO 5 yang digunakan sebagai pelarut untuk melarutkan ekstrak bunga petai tidak memiliki
kemampuan sebagai antibakteri. Hasil serupa ditunjukkan dalam penelitian Krishnavignesh, Mahalakshmipriya dan Ramesh 2013 menggunakan DMSO 5
sebagai kontrol negatif dengan metode difusi sumuran tidak menujukkan adanya penghambatan pertumbuhan bakteri uji. Hal ini didukung oleh penelitian Saputro
2014 yaitu “Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Etil Asetat Kulit Buah Manggis
Garcia magostana Linn terhadap E. coli ” dan Yulianingsih 2012 yang berjudul
“Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Belimbing Wuluh Averrhoa bilimbi L terhadap S. aureus dan S. epidermidis menunjukkan bahwa DMSO 10 dan DMSO
100 yang digunakan sebagai pelarut dengan metode difusi sumuran tidak menujukkan adanya potensi aktivitas antibakteri. Hasil yang diperoleh pada kontrol
kontaminasi media menunjukkan bahwa tidak adanya pertumbuhan bakteri pada media. Hal ini menunjukkan bahwa proses kerja yang dilakukan telah aseptis. Pada
kontrol pertumbuhan bakteri diperoleh hasil bahwa bakteri S. aureus dan E. coli yang digunakan dapat tumbuh subur dan optimal pada media yang digunakan yaitu pada
media MHA.
Hasil perlakuan menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga petai hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri S .aureus dibandingkan E. coli tabel IV yang
ditunjukkan dengan adanya zona hambat lampiran 7. Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan struktur atau komposisi dinding sel bakteri Gram negatif dan Gram
positif. Aktivitas antibakteri ekstrak etanol bunga petai terhadap bakteri S. aureus
dimungkinkan karena adanya kandungaan senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, terpenoid yang bersifat polar. Dinding sel bakteri Gram positif mengandung
peptidoglikan yang bersifat polar. Hal ini menyebabkan senyawa polar seperti alkaloid, flavonoid, saponin dan terpenoid dapat dengan mudah masuk menembus
barier membran luar, sedangkan membran luar bakteri Gram negatif mengandung komposisi lipid yang bersifat non polar sehingga senyawa polar dalam ekstrak etanol
bunga petai tidak dapat menembus membran sel bakteri Gram negatif. Mekanisme antibakteri senyawa alkaloid yaitu menyisip pada DNA sehingga
merubah struktur ikatan DNA dan dengan menghambat sintesis DNA dengan cara menghambat kerja enzim topoisomerase Karou, 2005. Flavonoid memberikan
aktivitas antibakteri dengan membentuk senyawa kompleks dengan protein ekstraseluler yang dapat merusak membran sel bakteri Ngajow, 2013, sehingga
fungsi membran sel sebagai osmoregulator menjadi terganggu mengakibatkan kematian bakteri. Mekanisme saponin dan terpenoid sebagai antibakteri dengan
merusak membran sitoplasma sehingga menyebabkan bakteri lisis Ngajow, 2013.
Tabel V. Kriteria Kekuatan Daya Antibakteri Esktrak Etanol Bunga Petai Terhadap S. aureus.
No Kriteria Davis and Stout 1971
Hasil Penelitian Diameter zona
hambat mm Kriteria
Konsentrasi Diameter zona
hambat mm Kriteria
1 5
Lemah 3,125
1,4 Lemah
2 5 -10
Sedang 6,25
3,7 Lemah
3 10-20
Kuat 12,5
8,1 Sedang
4 20
Sangat kuat 25
9,9 Sedang
50 12,3
Kuat Diameter zona hambat terbesar terdapat pada konsentrasi 50 . Besarnya
diameter zona hambat dipengaruhi oleh dua hal yaitu kemampuan ekstrak untuk berdifusi ke seluruh bagian media agar untuk menggaggu pertumbuhan bakteri uji
dan kepekaan atau sensitivitas bakteri uji terhadap suatu antibakteri. Kriteria kekuatan daya antibakteri ekstrak etanol bunga petai terhadap S. aureus dapat dilihat pada tabel
V. Berdasarkan kriteria tersebut diketahui bahwa konsentrasi ekstrak 50 merupakan konsentrasi efektif untuk menghambat S. aureus karena pada konsentrasi tersebut
daya antibakteri dikategorikan kuat yang ditunjukkan dengan parameter zona hambatan yang dihasilkan. Analisis data dilakukan pada kelompok S. aureus karena
kelompok tersebut memberikan diameter zona hambat sedangkan pada kelompok E. coli
tidak memberikan data diameter zona jernih. Tabel VI. Hasil Uji Statistik Diameter Zona Hambat Variasi Konsentrasi Ekstrak
Bunga Petai, Kontrol Positif dan Kontrol Negatif terhadap S. aureus. Uji Statistik
Hasil Uji Makna
Shapiro-Wilk W = 0,692
Distribusi tidak normal Levene
F = 5.446 Variansi tidak homogen
antar kelompok Kruskal Wallis
X
2
= 0,00041 Ada perbedaan antar
kelompok
Berdasarkan hasil uji statistik yang diperoleh tabel VI diketahui bahwa data terdistribusi tidak normal dan variansi tidak homogen. Analisis data dengan uji
Kruskal Wallis dengan taraf kepercayaan 95 menujukkan terdapat perbedaan yang
bermakna antar kelompok. Uji statistik dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk membandingkan perbedaan nilai diameter zona hambat dua kelompok antar
konsentrasi. Hasil uji Mann-Whitney menujukkan berbeda bermakna antara kelompok kontrol negatif dengan kelompok konsentrasi 50, 25 dan 12,5, sedangkan pada
kelompok konsentrsi 6,25 dan 3,125 bila dibandingkan dengan kontrol negatif menujukkan berbeda tidak bermakna Lampiran 8
. Berdasarkan data tersebut
menujukkan bahwa kosentrasi 50, 25 dan 12,5 ekstrak etanol bunga petai memiliki daya antibakteri yang bermakna sacara statistik tetapi tidak lebih baik
dibandingkan amoksisilin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga petai memiliki
aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. aureus dan tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli, oleh karena itu perlu dilakukan pengukuran KHM dan
KBM terhadap S. aureus.
G. Penentuan KHM dan KBM dengan Metode Dilusi Cair
