pada kelinci dari Sigma nomor produk E7028. Antibodi sekunder IgG kambing anti kelinci yang dilabeli dengan enzim HRP dari Cell Signaling Technology
nomor katalog 7074 dan substrat DAB diaminobenzidine. Peralatan untuk pewarnaan IHK meliputi gelas objek dan kaca penutup,
gelas piala, pipet, mikropipet, pemanas air, mikrotom, inkubator, alat penghitung waktu timer, lemari pendingin, lembar protokol IHK dan mikroskop.
3. 3. Tahapan Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap. Tahap pertama meliputi preparasi sampel daun cincau hijau P.oblogifolia Merr, pembuatan bubuk daun cincau hijau
dan pembuatan pakan yang digunakan untuk uji pada mencit C3H. Tahap kedua merupakan pengujian aktivitas antikanker dari bubuk daun cincau hijau
P. oblongifolia Merr. pada mencit C3H, meliputi tahapan penerapan pakan uji, transplantasi, dan terminasi. Tahap ketiga merupakan analisis histopatologis
secara HE dan tahap deteksi ekspresi enzim kaspase-7 dan protein kinase JNK-12 sebagai protein penanda proapoptosis dan enzim COX-2 dan protein kinase
ERK 12 sebagai protein penanda antiapoptosis dari jaringan kanker payudara mencit C3H dengan menggunakan metode IHK.
3. 3. 1. Pembuatan Bubuk Daun Cincau Hijau Chalid 2003
Pembuatan pakan mencit diawali dengan pembuatan bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. Pembuatan bubuk daun cincau hijau diawali sortasi
agar didapatkan daun yang bersih dari tangkai dan batang daun. 200 g daun cincau hijau yang telah bersih dicuci dan ditiriskan, setelah itu dilakukan penghalusan
menggunakan blender dengan perbandingan antara daun cincau dan air 1:3. Bubur daun cincau yang dihasilkan sampai menghasilkan gel, didiamkan semalam
dilemari es. Keesokan harinya gel dikeringkan menggunakan drum dryer, sehingga diperoleh bubuk daun cincau hijau kasar. Bubuk kasar daun cincau hijau
yang diperoleh dihaluskan menggunakan blender maka diperoleh bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. halus yang siap digunakan sebagai campuran
pada pakan mencit. Tahapan pembuatan tersebut secara lebih detil dapat dilihat pada Lampiran 1.
3.3.2. Pembuatan Pakan Mencit C3H AIN 1976
Pakan mencit yang digunakan pada penelitian ini merujuk pada penelitian Chalid 2003 dengan modifikasi pada persentase bubuk daun cincau yang
ditambahkan pada pakan mencit seperti yang telah dilaporkan oleh Widyanto 2010 dan Aryudhani 2011. Kelompok hewan coba yang diberi
bubuk daun cincau pada pakannya adalah kelompok C 0,88, D 1,76 dan E 2,64.
Komposisi pakan secara lengkap disajikan dalam Tabel 3. Tabel 3 Komposisi pakan standar dan pakan uji mencit C3H Chalid 2003
.
Komponen Komposisi
AIN1976 Kelompok mencit perlakuan
A gr B gr
C gr D gr
E gr Bubuk gel daun cincau
hijau 0,88
1,76 2,64
Kasein 20
21,90 21,90
21,74 21,57
21,40 Lemak minyak
jagung merek Mazola 5,0
4,95 4,95
4,93 4,91
4,90 Selulosa carboxyl
methyl cellulose 5,0
5,0 5,0
4,55 4,10
3,65 Mineral mix
3,50 2,85
2,85 3,28
3,21 3,14
Vitamin mix vitamin merek Fitkom
1,0 1,0
1,0 1,0
1,0 1,0
Air 10,0
8,31 8,31
8,29 8,28
8,26 Karbohidrat maizena
merek Honig Untuk
membuat 100
55,99 55,99
55,33 55,17
55,02
Pembuatan pakan mencit sesuai dengan komposisi pada Tabel 3, diawali dengan proses pencampuran bahan yang komposisinya paling kecil, yaitu vitamin
dan mineral, kemudian ditambahkan selulosa CMC dan kasein secara berurutan. Sementara itu pada wadah yang lain dilakukan pencampuran air dan tepung
maizena yang kemudian dibagi menjadi dua bagian yaitu 23 bagian disebut basis air dan 13 bagian disebut basis minyak. Pencampuran selanjutnya adalah vitamin,
mineral dan CMC dicampurkan pada basis minyak, diaduk sampai rata dan homogen, baru kemudian dilanjutkan dengan menyampurkan basis air. Setelah
tercampur rata kemudian dibuat pelet dan dikeringkan menggunakan cabinet
dryer selama 4-5 jam.
3.3.3. Pemeliharaan Mencit
Pengujian pada mencit C3H merupakan kerja tim yang terdiri dari empat orang peneliti, yaitu Emma Rochima, Nindira Aryudhani, Rachmat Widyanto dan
Mutiara Prihatini. Pemeliharaan mencit dilakukan selama 52 hari. Mencit C3H yang digunakan sebanyak 25 ekor mencit umur ±2 bulan. Mencit dibagi menjadi 5
kelompok perlakuan dimana setiap kelompok terdiri dari 5 individu. Hal ini sesuai dengan jumlah minimum ulangan untuk setiap perlakuan dengan rumus Federer :
Dimana t : jumlah perlakuan
n : jumlah ulangan minimum yang diperlukan Sehingga untuk 5 kelompok perlakuan minimum ulangan yang diperlukan adalah
5 ekor mencit. Setiap individu menempati satu kandang yang terbuat dari plastik. Setiap kelompok ditempatkan dalam rak bersusun. Semua hewan coba diletakkan
dalam ruang yang telah diatur siklus udara dan cahaya. Mencit dikelompokkan dengan perlakuan sebagai berikut :
Kelompok Keterangan
A =
Kontrol negatif, yaitu mencit diperi pakan standar 0 bubuk daun cincau hijau dan tidak ditransplantasi
tumor.
B =
Kontrol positif, yaitu mencit diperi pakan standar 0 bubuk daun cincau hijau dan ditransplantasi tumor
C,D,E =
Kelompok mencit perlakuan yang pada pakannya ditambahkan bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr
0,88, 1,76 dan 2,64 serta ditransplantasi tumor
Masa uji pada penelitian ini berlangsung selama 52 hari. Pada hari ke-1 sampai hari ke-30 semua hewan coba sudah diberi perlakuan pakan uji namun
belum dilakukan proses transplantasi sel kanker. Proses transplantasi sel kanker dilakukan pada hari ke-31. Pemeliharaan hewan coba dilanjutkan sampai hari
ke-52 dan pada hari ke-53 dilakukan terminasi. Pada penelitian ini tidak dilakukan masa adaptasi karena pemeliharaan
hewan coba yang digunakan tidak mengalami perubahan yaitu berasal dari Laboratorium Patologi Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas
