berarti bahwa bentuk sel sama sekali tidak mirip dengan sel asal. Rincian kriteria penilaian skor derajat diferensiasi dijelaskan sebagai
berikut : a. Tingkat Kepadatan Sel Tumor :
Skor 1 : tingkat kepadatan sel tumor rendah, ruang antar sel terlihat kurang rapat.
Skor 2 : tingkat kepadatan sel tumor sedang, ruang antar sel terlihat cukup rapat.
Skor 3 : tingkat kepadatan sel tumor tinggi, ruang antar sel terlihat sangat rapat. b. Tingkat Mitosis Sel :
Skor 1 : sel yang mitosis dengan jumlah sedikit 5-10 sel Skor 2 : sel yang mitosis dengan jumlah sedang 6-10 sel
Skor 3 : sel yang mitosis dengan jumlah banyak ≥ 11 sel
c. Pleomorfisme Inti Sel : Skor 1 : Bentuk sel beragam dan dapat dibedakan satu dengan yang lain,
ukuran sitoplasma besar, inti sel berukuran kecil, warna inti sel pada bagian dalam mulai lebih gelap pada bagian lain masih berwarna
lebih terang. Skor 2 : Bentuk sel mulai seragam, ukuran sitoplasma mulai mengecil, inti
sel mulai membesar dan semakin jelas duplikasidi dalam sel, warna inti sel semakin gelap.
Skor 3 : Bentuk sel seragam, ukuran sitoplasma mengecil, inti sel berukuran sangat besar, terlihat jelas duplikasi di dalam sel dan warna inti sel
gelap.
3.3.10. Pewarnaan Imunohistokimia Robinson et al. 1990
Pada pewarnaan imunohistokimia ada beberapa tahapan yang harus dilakukan sebelum pewarnaan IHK dilakukan, yaitu preparasi gelas obyek disebut
pelapisan coating yang digunakan untuk penempelan sampel menggunakan gelatin seperti pada Lampiran 31, pengirisan sectioning sediaan blok
embeding menggunakanan microtom rotary dengan ketebalan ± 4 µm, selanjutnya dilanjutkan dengan proses penempelan affixing sampel ke gelas obyek dan
kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan imunohistokimia. Metode IHK meliputi tiga langkah utama yaitu deparaffinisasi rehidrasi,
antigen unmasking dan pewarnaan staining. Proses penjernihan dilakukan sebelum proses rehidrasi menggunakan xylol. Rehidrasi diawali dengan
perendaman pro-analysis dengan konsentrasi menurun dari 100 sampai 70. Proses rehidrasi diakhiri dengan perendaman menggunakan aquades. Proses
selanjutnya adalah antigen unmasking. Pada proses ini dilakukan perebusan menggunakan larutan buffer natrium sitrat lampiran 31 yang bertujuan untuk
membuka epitop antigen. Suhu perebusan dijaga sekitar 85
Proses pewarnaan IHK diawali dengan perendaman sampel dengan aquades, pada proses ini penggunaan pap-pen yang mengandung 1-bromopropan
untuk membatasi jaringan yang akan diwarnai. Hal ini agar larutan perendam tidak tercecer dan jaringan yang akan dianalisa dipastikan terendam oleh larutan.
Proses selanjutnya gelas objek tidak lagi direndam melainkan ditetesi menggunakan pipet tetes. Proses ini dilakukan di box yang dialasi menggunakan
tissu yang dibasahi agar dapat mempertahankan kelembaban supaya jaringan tidak cepat kering.
C selama 10 menit kemudian dilakukan proses pendinginan.
Proses selanjutnya inkubasi menggunakan larutan 3 H
2
O
2
dalam dH
2
Kemudian proses inkubasi dengan antibodi primer dilakukan pada suhu 4
O selama 10 menit dengan cara diteteskan. Kemudian proses pencucian
menggunakan larutan PBS phosphate buffer saline, pada larutan PBS tidak lupa ditambahkan Tween 20 yang bertujuan untuk menyatukan PBS dan protein target
serta membersihkan protein-protein lain bukan menjadi target. Jaringan pada gelas obyek ditetesi dengan larutan protein pemblok skim milk dalam PBS sebanyak
100 - 400 µL selama 60 menit pada suhu ruang.
C selama semalam. Volume larutan antibodi primer yang diteteskan adalah 100-400
μL dengan pengenceran 1:100. Penetesan larutan antibodi primer dilakukan dengan mikropipet. Perendaman ini bertujuan mengefektifkan reaksi
antara antigen yang terdapat pada jaringan dengan antibodi primer reaksi Ag-Ab. Pada penelitian ini, antibodi primer yang digunakan ada empat
macam, yaitu antiphospho-JNK12 yang berasal dari manusia dikembangkan
pada kelinci dari Sigma nomor produk J4644 dan anti COX-2 yang berasal dari kelinci dikembangkan pada tikus dari Cayman Chemical nomor katalog 160116,
antibodi primer antikaspase-7 yang berasal dari manusia dikembangkan pada kelinci dari Sigma nomor produk C7724, antiphospho-ERK12 yang berasal dari
manusia yang dikembangkan pada kelinci dari Sigma nomor produk E7028. Setelah diinkubasi selama semalam, larutan antibodi primer dilarutkan
menggunakan larutan PBS sebanyak tiga kali, masing-masing selama 5 menit. Perendaman selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam larutan antibodi
sekunder dengan proses inkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Perendaman dengan antibodi sekunder dilakukan dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan.
Volume larutan antibodi sekunder yang diteteskan adalah 100-400 μL dengan
pengenceran 1:1000. Pada penelitian ini, antibodi sekunder yang digunakan adalah antibodi sekunder IgG kambing anti kelinci yang dilabel dengan enzim
HRP horseradish peroxidase. Selanjutnya, jaringan diinkubasi dengan larutan DAB diaminobenzidine sebagai substrat bagi enzim HRP. Reaksi antara DAB
dan enzim HRP menghasilkan warna coklat. Selanjutnya dilakukan pencucian menggunakan aquades, kemudian
dilakukan perendaman menggunakan hematoksilin untuk mewarnai inti dan jaringan terfiksasi dengan warna ungu. Perendaman dilanjutkan dengan proses
rehidrasi, clearing, dan mounting. Sampel selanjutnya siap diamati di bawah mikroskop dan direkam dengan
foto digital. Pengamatan terhadap sampel dengan pewarnaan IHK adalah menghitung jumlah sel yang positif yang telah diwarnai dengan antibodi primer
antiphospho-JNK 12, anti-COX-2, antikaspase-7 dan antiphospho-ERK 12 diberi skor secara terpisah oleh peneliti dengan dua kali pembacaan pada waktu
yang berbeda dan dilakukan secara semikuantitatif. Skor IHK mengikuti cara Esteva et al. 2004. Distribusi sel yang positif
dan intensitas warna dievaluasi sebagai berikut: 0= tidak terdapat area berwarna coklat.
1= 10 sel yang positif 2= 10-50 sel yang positif
3= 50 sel yang positif
