usus yang telah diambil dibuka lumennya, setelah itu bagian ujung-ujung usus tersebut disteples pada kertas karton dengan pemukaan dalam dibagian atasnya.
Fiksasi kesemua bagian usus yang telah diambil ke dalam larutan Buffer Neutral Formalin
atau BNF 10 selama dua hari.
3.3.6 Pembuatan Sediaan Histopatologi
Pembuatan sediaan histopatologi diawali dengan pemotongan tipis pada bagian usus yang telah diawetkan dalam larutan Buffer Neutral Formalin atau
BNF 10 selama dua hari. Bagian usus dipotong dengan lebar 0.5 cm sehingga
dapat dimasukkan kedalam Tissue Casset dan dikelompokkan sesuai kelompoknya. Dehidrasi dilakukan dengan cara merendam sediaan tersebut secara
berturut-turut kedalam alkohol 70, 80, 90, alkohol absolut II, xylol I, xylol II, parafin I dan parafin II. Proses perendaman pada setiap bahan dilakukan
selama 2 jam dan berjalan secara otomatis dalam alat automatic tissue processor. Proses dilanjutkan dengan pencetakkan sampel organ dalam paraffin agar
membentuk blok jaringan sehingga dapat dipotong menggunakan mikrotom setebal 5 µm. Potongan blok paraffin berbentuk pita ribbon, diletakan di atas
permukaan air hangat 45°C dengan tujuan untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan. Sediaan diangkat dari permukaan air dengan gelas objek yang telah
diulasi larutan albumin yang berfungsi sebagai perekat. Sediaan selanjutnya dikeringkan dalam inkubator suhu 60°C selama 24 jam.
Proses pewarnaan diawali dengan deparafinisasi ke dalam xylol sebanyak dua kali, masing-masing selama dua menit. Sediaan selanjutnya melalui proses
rehidrasi. Proses rehidrasi dimulai dari alkohol absolut sampai ke alkohol 80, yang masing-masing lamanya 2 menit. Sediaan selanjutnya dicuci dengan air
mengalir dan dikeringkan. Sediaan yang telah kering diwarnai dengan pewarnaan Mayer’s Hemaktosilin selama 8 menit, dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan
pewarna Eosin selama dua menit. Sediaan kemudian dicuci dengan air mengalir
untuk menghilangkan warna Eosin yang berlebih sebelum akhirnya dikeringkan. Sediaan kemudian dicelupkan kedalam alkohol 90 sebanyak 10 kali
celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit. Sediaan ditetesi perekat
permount , ditutup dengan gelas penutup, dan dibiarkan kering sesuai dengan
metode Bagian Patologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Sediaan siap dilihat dan setelah perekat kering diamati menggunakan mikroskop cahaya.
Selain pewarnaan Hematoksilin-eosin HE seperti yang dijelaskan di atas, dilakukan pula pewarnaan Periodic Acid Schiff PAS untuk melihat sel goblet
lebih jelas. Pewarnaan Periodic Acid Schiff PAS diawali dengan deparafinisasi, kemudian preparat dibilas dengan akuades lalu direndam kedalam larutan asam
asetat 1 selama 5 menit dan dibilas kembali dengan akuades. Preparat selanjutnya dioksidasi dalam periodc acid 1 selama 5-10 menit, lalu bilas
dengan akuades tiga kali masing-masing 5 menit. Preparat dimasukkan kedalam schiff reagent
selama 15-30 menit, dibilas lagi dengan air sulfit 10 sodium bisulfat
NaHSO
3
10 ml, 1 N HCl 10 ml dan akuadesilata 200 ml dengan masing-masing 2 menit selama bilasan pada masing-masing larutan. Setelah itu
preparat dibilas dengan air kran mengalir selama 10-15 menit lalu dibilas dengan akuades. Terakhir dilakukan dehidrasi dengan xylol kemudian ditetesi perekat
permount , ditutup dengan gelas penutup, dan dibiarkan kering sesuai dengan
metode Bagian Patologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Sediaan siap dilihat dan setelah perekat kering diamati menggunakan mikroskop cahaya.
3.3.7 Pengamatan Histopatologi
Pengamatan histopatologi dilakukan secara deskriptif maupun kuantitatif menggunakan mikroskop dengan perbesaran 200 kali 20x objektif dan 10x
okuler dan 400 kali 40x objektif dan 10x okuler serta dibuat foto menggunakan digital eyepiece camera
. Pengambilan foto dilakukan sebanyak 10 lapangan pandang pada masing-masing kelompok dengan tiga kali perulangan. Rata-rata
luas lapang pandang pada foto dengan perbesaran 200 kali ialah 58 987 µm
2
sedangkan pada foto dengan perbesaran 400 kali ialah 243 044 µm
2
. Pengamatan pada bagian usus tersebut ialah untuk melihat a persentase kerusakan vili usus b
jumlah kripta usus c jumlah sel goblet, dan d tinggi vili usus. Untuk perhitungan jumlah sel goblet maka preparat histopatologi usus diberi pewarnaan khusus yakni
Periodic Acid Schiff PAS. Perhitungan menggunakan software Image J
Launcher.
