digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. Pereaksi berwarna jingga.
2 Steroidtriterpenoid
Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi. Anhidrida asetat sebanyak 10 tetes dan asam sulfat pekat sebanyak 3 tetes
ditambahkan ke dalam campuran tersebut. Hasil uji positif sampel mengandung steroid dan triterpenoid yaitu terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama
kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau.
3 Saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan
sampel mengandung saponin.
4 Flavonoid
Sejumlah sampel ditambah serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume sama dan
4 ml alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid, yaitu terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil
alkohol.
5 Fenol hidrokuinon
Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl
3
5. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol, yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru.
6 Molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambahkan 2 tetes pereaksi molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Hasil uji positif sampel
mengandung karbohidrat ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
7 Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif
sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau, kuning atau endapan merah bata.
8 Biuret
Larutan sampel sebanyak 1 ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml. Campuran dikocok dengan seksama. Hasil uji positif sampel mengandung
senyawa peptida yaitu terbentuknya larutan berwarna ungu.
9 Ninhidrin
Larutan sampel sebanyak 2 ml ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil
uji positif sampel mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru.
3.4.7 Analisis aktivitas antioksidan DPPH Blois 1958 diacu dalam Hanani et al. 2005
Ekstrak lintah laut dari hasil ekstraksi bertingkat dan hasil pemurnian dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm.
Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi yang
sama dengan sampel. Larutan DPPH yang akan digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM.
Masing-masing sampel uji dan pembanding diambil 4,50 ml dan direaksikan dengan 500 µl larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda
dan telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama
30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari
larutan blanko juga diukur untuk melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 4,50 ml pelarut metanol dengan 500 µl larutan
DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Nilai persentase aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus:
100 x
blanko Absorbansi
sampel Absorbansi
- blanko
Absorbansi Inhibisi
=
Nilai persentase inhibisi diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear untuk mencari nilai IC
50
inhibitor concentration 50.
3.5 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah menggunakan rancangan acak lengkap faktorial untuk aktivitas antioksidan
ekstrak kasar dengan 2 perlakuan yaitu jenis pelarut kloroform, etil asetat dan etanol dan bagian lintah laut daging dan jeroan dengan 2 kali ulangan. Model
matematis rancangan percobaan tersebut menurut Steel dan Torrie 1995 adalah:
ijk ij
ij ij
ijk
Y ε
αβ β
α µ
+ +
+ +
= Keterangan :
Y
ijk
: Nilai pengamatan pada suatu percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ke-i dan ke-j
µ : Nilai tengah populasi
α
i
: Pengaruh perlakuan jenis pelarut ke-i kloroform, etil asetat, dan etanol β
ij :
Pengaruh perlakuan bagian lintah laut ke-j daging dan jeroan αβij: Pengaruh interaksi jenis pelarut ke-i, dengan bagian lintah laut ke-j
ε
ijk :
Pengaruh galat pada percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan jenis pelarut dan bagian lintah laut
Rancangan yang digunakan pada analisis aktivitas antioksidan hasil fraksinasi, yaitu menggunakan rancangan acak lengkap biasa. Perlakuan yang
digunakan adalah fraksi dengan 2 kali ulangan. Model matematis rancangan percobaan tersebut. Model matematis rancangan percobaan tersebut menurut Steel
dan Torrie 1995 adalah:
ij i
ij
P Y
ε +
+ =
µ Keterangan :
Y
ij
: Nilai pengamatan respon dari faktor perlakuan fraksi ke-i dan ulangan ke-j
µ : Nilai rata-rata yang sesungguhnya
Pi : Pengaruh perlakuan fraksi ke-i
ε
ij :
Pengaruh galat pada perlakuan fraksi ke-i dan ulangan ke-j
