40 H
2
O
2
yang tersisa. Jumlah H
2
O
2
yang dipakai katalase = 0,2 M – konsentrasi H
2
O
2
terbaca.
3.5.8 Glutation Peroksidase Paglia and Valentine, 1967
Prinsip metode ini berdasarkan kemampuan glutation peroksidase mengkatalisasi glutation tereduksi menjadi glutation teroksidasi. Glutation
teroksidasi direduksi kembali menjadi glutation tereduksi oleh enzim glutation reduktase dengan kofaktor NADP dalam suasana asam. Jumlah glutation tereduksi
diukur dengan menentukan jumlah mikromol NADPH sebagai pereduksi yang diukur secara spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm.
a. Pembuatan pereaksi-pereaksi analisis glutation peroksidase 1. Larutan NADPH 1,5 mM dalam NaHCO
3
0,1 NaHCO
3
0,1 dibuat dengan cara melarutkan 0,1 g NaHCO
3
dengan 100 mL air bebas ion. Selanjutnya sebanyak 12,5 mg NADPH BM
833,4 dilarutkan sampai volume 10 mL dengan NaHCO
3
a. Tabung a berisi NaHPO 0,1.
2. Larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0 mengandung 0,001 M Na-EDTA
4
b. Tabung b berisi Na BM 138 sebanyak 3,45 g yang dilarutkan
dengan air bebas ion hingga volume menjadi 250 mL
2
HPO
4
c. Tabung c berisi Na-EDTA C BM 142 sebanyak 3,55 g yang
dilarutkan dengan air bebas ion hingga volume menjadi 250 mL
10
H
14
N
2
O
8
Na
2
.2H
2
d. Campurkan larutan b dan c. Kemudian tambahkan sedikit demi sedikit dengan larutan a sambil dicek pHnya dengan pH meter
sampai menunjukkan 7,0. O, BM 372,2
sebanyak 3,722 mg yang dilarutkan dengan air bebas ion menjadi 100 mL
b. Pembuatan larutan standar glutation reduktase 2,4 Umg protein Glutation reduktase 198 unitmg protein dilarutkan dengan 10 mL bufer
forfat pH 7,0 dan dinyatakan sebagai larutan standar kerja. Larutan standar kerja ini kemudian diencerkan sehingga didapatkan larutan glutation reduktase 2,4
Umg dengan menggunakan bufer fosfat. c. Pembuatan larutan glutation 10 mM
41 Sebanyak 25 mg glutation BM 250,3 dilarutkan sampai 10 mL dengan
menggunakan air bebas ion. d. Pembuatan larutan H
2
O
2
1,5 mM Larutan H
2
O
2
1,5 mM dibuat dengan cara mengencerkan 15,306 µL H
2
O
2
30 dengan air bebas ion hingga volume menjadi 100 mL. e. Prosedur analisis
Bufer fosfat 0,1 M pH 7,0 sebanyak 200 µL, 200 µL sampel, 200 µL
glutation 10 mM, dan 200 µL glutation reduktase 2,4 Unit dicampur. Campuran
larutan tersebut selanjutnya diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37
o
C. Selanjutnya ke dalam larutan ditambahkan 200
µL NADPH 1,5 mM dan diinkubasi lagi pada suhu yang sama selama 3 menit. Akhirnya H
2
O
2
Vs x
6,22 Vt
serapan x δ
1,5 mM sebanyak 20
µL ditambahkan dalam campuran tersebut. Serapan larutan dibaca di antara waktu 1-2 menit pada panjang gelombang 340 nm. Aktivitas glutation
peroksidase ditentukan berdasar rumus: mUnit GSH-Px =
x 2 x 1000 x protein
mg 1
keterangan: δ serapan = perubahan serapan
Vt = volume total dalam mL Vs = volume sampel dalam mL
6,22 = faktor ekstrinsik dari NADPH 2
= 2 mol glutation yang setara dengan 1 mol NADPH 1000 = perubahan menjadi miliunit
3.5.9 Kandungan Cu,Zn-SOD pada Hati dan Ginjal secara imunohistokimia Wresdiyati
Kategori