36 Darah diambil dari jantung dengan semprit. Darah yang didapat ditampung
dan ditempatkan pada suhu ruang hingga terbentuk gumpalan darah, selanjutnya darah disentrifus 251,5 g selama 10 menit untuk mendapatkan dua bagian.
Lapisan atas yang jernih merupakan serum darah dan diambil untuk segera dianalisis kandungan peroksida lemak dan aktivitas antioksidan enzimnya.
b. Pembuatan larutan standar Larutan standar berkadar 2,5 dibuat dengan mencampurkan 200
µL SDS, 50 µL EDTA, 1500 µL TBA, 1150 µL aquades, dan 100 µL tetrametoksipropan ke
dalam tabung reaksi. Setelah divorteks campuran ditambah 1500 µL TCA.
c. Pembuatan larutan blanko Larutan blanko dibuat dengan cara mencampurkan 200
µL SDS, 50 µL BHT, 50
µL EDTA, 1500 µL TBA, dan 1250 µL aquades ke dalam tabung reaksi. Setelah divorteks campuran ditambah 1500
µL TCA. d. Pembuatan larutan uji
Larutan uji dibuat dengan cara mencampurkan 200 µL SDS, 50 µL EDTA,
1500 µL TBA, dan 1250 µL plasma darah ke dalam tabung reaksi. Setelah
divorteks campuran ditambah 1500 µL TCA.
e. Pengujian peroksida lemak Larutan blanko, standar, dan uji setelah ditambah TCA disentrifus 10 g
selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan dimasukkan dalam tabung reaksi. Selanjutnya tabung tersebut ditutup dengan kelereng dan
ditempatkan pada penangas air bersuhu 80
o
mL nmol
C selama 20 menit. Selanjutnya supernatan diukur serapannya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang
532 nm. Kadar peroksida ditentukan dengan rumus:
Kadar Peroksida lemak TBARS =
blanko std
blanko uji
Abs Abs
Abs Abs
− −
x [Std]
3.5.6 Superoksida Dismutase Misra and Fridovich, 1972
Prinsip metode ini berdasarkan kemampuan SOD dalam menghambat autooksidasi epinefrin menjadi adenokrom. Satu unit aktivitas SOD adalah
kemampuan menghambat 50 autooksidasi epinefrin menjadi adenokrom. Warna
37 coklat dari adenokrom diukur secara spektrofotometer pada panjang gelombang
480 nm.
a. Pembuatan pereaksi-pereaksi analisis SOD 1. Larutan epinefrin
Larutan epinefrin 0,003 M dibuat dengan jalan melarutkan 5,496 mg epinefrin berberat molekul 1832 dalam 10 mL HCl 0,01 N simpan
dalam botol berwarna. Larutan ini tahan untuk beberapa hari pada suhu 40
o
a. Tabung a berisi Na C.
2. Larutan bufer natrium karbonat
2
CO
3
.10H
2
b. Tabung b berisi NaHCO O BM 286 sebanyak 3,575 g yang
dilarutkan dengan air bebas ion menjadi 250 mL
3
c. Tabung c berisi Na-EDTA C BM 84 sebanyak 1,05 g yang dilarutkan
dengan air bebas ion menjadi 250 mL
10
H
14
N
2
O
8
Na
2
.2H
2
d. Pada gelas ukur 1000 mL bersih tambahkan larutan a, b, dan c sedikit demi sedikit sambil dicek pHnya dengan pH meter sampai
menunjukkan 10,2 tahan sampai 2 bulan pada suhu ruang O, BM 372,2
sebanyak 3,722 mg yang dilarutkan dengan air bebas ion menjadi 100 mL
b. Pembuatan larutan standar SOD 3394,3 unit dilarutkan dalam 10 mL air bebas ion dan dinyatakan
sebagai larutan standar kerja. Larutan standar kerja ini selanjutnya dibuat seri larutan standar SOD dengan menggunakan air bebas ion yaitu: 0, 50, 100, 150,
200, 250, 300 unit. Larutan standar 0 unitmL dibuat dengan cara memipet 0 µL
larutan standar kerja dan memasukkannya ke dalam tabung. Kemudian tabung diisi dengan 200
µL air bebas ion. Larutan standar 50 unitmL dibuat dengan cara memipet 29,5
µL larutan standar kerja dan memasukkannya ke dalam tabung. Kemudian tabung diisi dengan 170,5
µL air bebas ion. Demikian seterusnya hingga larutan standar 300 unitmL
c. Pembuatan larutan berbahan uji dan tidak berbahan uji
38 Larutan bahan uji dibuat dengan memasukkan ke dalam kuvet 3 mL bufer
natrium karbonat 2800 µL, sampel atau larutan standar 100 µL, dan 100 µL
epinefrin. Larutan tidak berbahan uji dibuat dengan memasukkan 2800 µL bufer
natrium karbonat, 100 µL air bebas ion, dan 100 µL epinefrin.
d. Prosedur analisis Larutan berbahan uji atau tidak diukur serapannya segera setelah
penambahan epinefrin pada panjang gelombang 480 nm dengan suhu 30
o
sampel tanpa
menit tiap
absorbansi δ
sampel menit
tiap absorbansi
δ sampel
tanpa menit
tiap absorbansi
δ −
C. Pengukurannya adalah pada menit ke-1, 2, 3, dan 4 setelah penambahan epinefrin.
δ nilai serapan harus 0,025menit, jika lebih maka bahan diencerkan dengan bufer. Satuan aktivitas SOD dinyatakan dengan satuan Unitmg protein setelah
didapatkan persamaan regresi linier. Persamaan linier dibuat dari berbagai titik persentase hambatan sebagai absis x dan konsentrasi larutan standar sebagai
ordinat y. Besaran persentase hambatan didapatkan berdasar rumus sebagai berikut:
Persentase hambatan = x 100
UmL = 0,1
x 0,5
n pengencera
faktor x
hambatan
3.5.7 Katalase Sinha, 1972 Prinsip metode yang dikembangkan oleh Sinha menggunakan zat warna
sebagai indikator. Zat warna yang digunakan adalah potasium bikromat K
2
Cr
2
O
7
5 dalam suasana asam asetat glasial 1:3. Ion bikromat dalam suasana asam akan direduksi oleh H
2
O
2
menjadi kromat dan memberikan warna pada panjang gelombang 570 nm. 1 unit aktivitas katalase dinyatakan sebagai
banyaknya H
2
O
2
dalam mol yang digunakan oleh katalase tiap menit. H
Cr
+ +6
+ H
2
O
2
Cr
+3
+ H
2
O + O
2
a. Pembuatan pereaksi-pereaksi analisis katalase 1. Larutan K
2
Cr
2
O
7
5
39 Potasium bikromat seberat 5 g dilarutkan dengan 100 mL air bebas ion.
Selanjutnya ditambah asam asetat glasial dengan perbandingan 1:3, yaitu 50 mL larutan potasium bikromat dengan 150 mL asam asetat
glasial. 2. Larutan bufer fosfat 0,05M pH 7,0
a. Tabung a berisi KH
2
PO
4
b. Tabung b berisi Na BM 136,09 sebanyak 1,7 g yang
dilarutkan dengan air bebas ion sampai volume 250 mL
2
HPO
4
c. Ke dalam larutan b ditambahkan sedikit demi sedikit larutan a sambil dicek pHnya hingga pH = 7,0.
BM 142 sebanyak 1,775 g yang dilarutkan dengan air bebas ion sampai volume 250 mL
b. Pembuatan larutan standar Larutan H
2
O
2
30 BM 34,01 ≈ 9,8 M dipipet sebanyak 4,1 mL,
kemudian diencerkan dengan air bebas ion hingga volume menjadi 100 mL dan dinyatakan sebagai larutan standar kerja 0,4 M. Larutan standar kerja ini
selanjutnya dibuat seri larutan standar H
2
O
2
dengan menggunakan air bebas ion yaitu: 0, 0,04; 0,08; 0,12, 0,16; 0,2; dan 0,4 M. Larutan standar 0 M dibuat dengan
cara memipet 0 mL larutan standar kerja dan memasukkannya ke dalam tabung. Kemudian tabung diisi dengan 10 mL air bebas ion. Larutan standar 0,04 M
dibuat dengan cara memipet 1 mL larutan standar kerja dan memasukkannya ke dalam tabung. Kemudian tabung diisi dengan 9 mL air bebas ion. Demikian
seterusnya hingga larutan standar 0,4 M. c. Pembuatan larutan uji
Larutan bahan uji dibuat dengan mencampurkan 1 mL sampel dengan 5 mL bufer fosfat 0,05M pH 7,0 dan divorteks. Selanjutnya ditambah 4 mL H
2
O
2
Larutan uji dan standar sebanyak 1 mL dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya ditambah 2 mL indikator pewarna. Tabung reaksi
dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, baca serapannya pada panjang gelombang 570 nm. Serapan yang terbaca setara dengan konsentrasi
0,2 M dan diinkubasi selama 30 detik.
d. Prosedur analisis
40 H
2
O
2
yang tersisa. Jumlah H
2
O
2
yang dipakai katalase = 0,2 M – konsentrasi H
2
O
2
terbaca.
3.5.8 Glutation Peroksidase Paglia and Valentine, 1967
