52
Gambar 7 menunjukkan bahwa florotanin dalam ekstrak metanol mempunyai aktivitas antioksidan yang paling kuat. Lopez et al. 2011
melaporkan bahwa makin tinggi kadar polifenol rumput laut maka makin kuat aktivitas antioksidannya, namun Nakai et al. 2006, Shibata et al. 2008, dan Li
et al . 2009 melaporkan bahwa yang berperan kuat terhadap aktivitas
antioksidan rumput laut coklat adalah struktur konformasi florotaninnya. Hal ini menunjukkan bahwa florotanin yang terlarut dalam metanol mempunyai
konformasi struktur yang mudah mengabstraksi hidrogen. Shibata et al. 2008 menjelaskan bahwa keberadaan gugus hidroksil yang menempel pada cincin
aromatis berperan sangat penting dalam kemampuan pereduksian radikal bebas. Kuatnya aktivitas antioksidan florotanin dalam ekstrak juga dipengaruhi
oleh entalpi disosiasi ikatan hidrogennya. Bila entalpi disosiasi ikatan hidrogen suatu polifenol kecil, maka pemindahan hidrogen ke radikal bebas akan lebih
mudah Nielsen dan Ingold 2006. Berdasar penjelasan di atas tampak bahwa florotanin dalam ekstrak metanol S. echinocarpum mempunyai gugus hidroksil
yang lebih banyak, konformasinya lebih mudah dalam menstabilisasi struktur, dan mempunyai entalpi disosiasi ikatan hidrogen yang lebih kecil dibanding florotanin
dalam ekstrak S. echinocarpum dalam pelarut lainnya.
4.2.4 Identitas florotanin
Berdasarkan hasil uji aktivitas antioksidan, maka ekstrak metanol dipilih untuk diuji lebih lanjut, yaitu: elusidasi struktur florotanin yang terkandung dalam
ekstrak, uji toksisitas, uji disfungsi sel endotelium aorta, dan uji stres oksidatif. Elusidasi struktur florotanin yang terkandung dalam ekstrak S.
echinocarpum melalui beberapa tahap, yaitu: partisi, fraksinasi, dan identifiksi.
Ekstrak metanol S. echinocarpum dipartisi dietil eter, air, kloroform dan metanol
pada corong pemisah, lalu fase metanol ditampung. Hasil partisi terhadap ekstrak
metanol S. echinocarpum berupa partisi metanol dapat dilihat pada Gambar 8.
53
Gambar 8. Partisi metanol dari ekstrak metanol S. echinocarpum Partisi metanol yang didapat selanjutnya difraksinasi dalam kolom
kromatografi berisi silika gel G-60, 200-500 µm 20 cm, id 1 cm. Elusi dilakukan
dengan kloroform:metanol 8:2, kloroform:metanol 5:5 dan kloroform:metanol 2:8 masing-masing 40 mL. Hasil penampungan eluat dalam botol 2,5 mL
didapatkan dua eluat, yaitu: eluat pertama pada fraksi nomer 11-20 dan eluat kedua pada fraksi nomer 33-37. Kedua eluat tersebut dapat dilihat pada Gambar 9.
fraksi no 11-20 Gambar 9. Eluat pertama A dan eluat kedua B
Kedua eluat selanjutnya diidentifikasi kandungannya pada kromatografi lapis tipis KLT silika gel F
254
dengan eluen kloroform:metanol:air:asam asetat 53:38:6:3 dan menggunakan floroglusinol sebagai senyawa standar. Sebelum di
identifikasi dengan KLT, eluat dipekatkan, ditambah Na
2
CO
3
anhidrat, dicuci metanol tiga kali, dibekukan semalam dan didapatkan kristal putih. Hasil
identifikasi eluat pada KLT berupa noktah dapat dilihat pada Gambar 10. B
A
54
AU
0.00 0.10
0.20 0.30
0.40 0.50
0.60 0.70
0.80 0.90
1.00 1.10
nm 200.00
250.00 300.00
350.00
190.6
Gambar 10. Noktah floroglusinol, eluat pertama dan kedua Gambar 10 memperlihatkan bahwa faktor retensi R
f
noktah eluat pertama menyerupai R
f
senyawa standar yaitu 0,92 dan dapat dinyatakan bahwa eluat pertama adalah floroglusinol. Sementara itu R
f
Gambar 11. Spektra serapan ultra ungu eluat kedua dari ekstrak metanol
S. echinocarpum noktah eluat kedua adalah 0,26.
Karena belum didapatkan identitas pada eluat kedua maka dilakukan identifikasi lebih lanjut dengan metode spektroskopi.
Metode spektroskopi ultra ungu bertujuan untuk mendapatkan gambaran transisi energi dari elektron terluar. Hasil serapan ultra ungu eluat kedua dari
ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 11. Floroglusinol
Eluat pertama
Eluat kedua
55 Gambar 11 memperlihatkan bahwa serapan ultra ungu eluat kedua dari
ekstrak metanol S. echinocarpum berupa serapan tunggal pada panjang gelombang maksimal sekitar 210 nm. Shibata et al. 2006 melaporkan tipikal
profil spektra ultra ungu senyawa florotanin berada pada panjang gelombang 210 nm. Glombitza dan Rosener 1974 melaporkan bahwa serapan maksimal ultra
ungu bifuhalol dari rumput laut coklat Bifurcaria bifurcata pada 209,5 nm. Silverstein et al. 2005 menyatakan serapan ultra ungu tunggal dengan intensitas
rendah hingga menengah terjadi pada panjang gelombang di bawah 220 nm menunjukkan adanya transisi n
→ σ. Transisi ini oleh Pavia et al. 2009 dinyatakan sebagai transisi senyawa yang mengandung gugus fungsional alkohol
dan eter. Benzena mempunyai dua serapan maksimal yaitu serapan primer pada
panjang gelombang 180 dan 202 nm, dan serapan sekunder pada 255 nm Pavia et al.
2009. Saat atom hidrogennya tersubstitusi gugus hidroksil, serapan ini akan mengalami pergeseran batokromis sekitar 8 nm untuk serapan primer dan 16 nm
untuk serapan sekunder. Namun bila senyawa ini dilarutkan dalam pelarut polar serapan sekundernya akan tidak nampak. Hal inilah yang menyebabkan spektra
ultra ungu eluat kedua hanya tunggal. Sementara itu Pretsch et al. 2009 menyatakan bahwa suatu polisubstitusi benzena dengan substituennya berupa
gugus hidroksil akan mempunyai serapan maksimal 209-210,5 nm. Berdasarkan interpretasi terhadap serapan ultra ungu, maka eluat kedua
adalah senyawa yang mengandung gugus fungsional alkohol, eter dan benzena. Benzena yang terdapat pada eluat ini bersubstituen berupa polihidroksil.
Metode spektroskopi infra merah bertujuan untuk mendapat gambaran gugus fungsional suatu molekul. Hasil serapan infra merah eluat kedua dari ekstrak
metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 12.
56
600 800
1000 1200
1400 1600
1800 2000
2400 2800
3200 3600
4000 1cm
35 40
45 50
55 60
65 70
75 80
85 90
95 100
T
3550. 95
3477. 66
3439. 08
3406. 29
3381. 21
3344. 57
3313. 71
2943. 37
2694. 56
2052. 26
1637. 56
1624. 06
1404. 18
1303. 88
1247. 94
1217. 08
1078. 21
1035. 77
950. 91
883. 40
680. 87
653. 87
605. 65
545. 85
SARGASSUM
T
Gambar 12. Spektra serapan infra merah eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum
Gambar 12 memperlihatkan adanya beberapa puncak serapan yang menunjukkan gugus fungsional pembentuk senyawa dari eluat metanol kedua.
Puncak serapan itu antara lain: 3406 cm
-1
, 2943 cm
-1
, 2694 cm
-1
, 2052 cm
-1
, 1637 cm
-1
, 1404 cm
-1
, 1303 cm
-1
, 1247 cm
-1
, 1217 cm
-1
, 1078 cm
-1
, 1035 cm
-1
, 950 cm
- 1
, 883 cm
-1
, 680 cm
-1
, 653 cm
-1
, 605 cm
-1
, dan 545 cm
-1
. Menurut Pavia et al. 2009 serapan pada 3406 cm
-1
menunjukkan adanya gugus hidroksil, pasangan serapan 1637 cm
-1
dan 1404 cm
-1
menunjukkan aromatis eter, pasangan serapan 1247 cm
-1
dan 1035 cm
-1
menunjukkan keberadaan fenil eter, serapan pada 1217 cm
-1
menunjukkan gugus C-O fenol, dan pasangan serapan 883 cm
-1
dan 680 cm
-1
1cm
menunjukkan out of plane dari suatu model trisubstitusi 1, 3, dan 5. Berdasar interpretasi serapan infra merah tersebut dapat disimpulkan bahwa senyawa yang
terkandung dalam eluat metanol kedua merupakan senyawa fenil eter yang mengandung senyawa hidroksil pada posisi atom karbon nomer 1, 3, dan 5.
57
AU
0.00 0.50
1.00 1.50
2.00
Minutes 2.00
4.00 6.00
8.00 10.00
Metode kromatografi cair kinerja tinggi dapat digunakan untuk menentukan kemurnian suatu zat dari suatu hasil isolasi. Kromatogram eluat metanol kedua
dari ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 13.
Gambar 13. Kromatogram eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 13 memperlihatkan bahwa eluat kedua dari ekstrak metanol S.
echinocarpum yang diinjeksi dan dielusikan dalam kolom High Performace
Liquid Chromatography HPLC hanya berupa puncak tunggal. Berdasarkan hasil
elusi ini dapat dikatakan bahwa eluat hanya mengandung satu senyawa. Gambar 13 juga memperlihatkan bahwa eluat uji yang dielusikan pada
sistem kromatografi ini termasuk senyawa polar. Hal ini dimungkinkan karena fase gerak dalam sistem kromatografi ini adalah pelarut polar 95 H
2
Metode spektroskopi spektra massa bertujuan untuk mendapatkan berat molekul senyawa uji. Spektra massa eluat kedua dari ekstrak metanol S.
echinocarpum yang dianalisis dengan High Performance Liquid Chromatography
O + 0.05 asam format, 5 asetonitril. Berdasar interaksi inter dan intra molekular senyawa
dengan fase diam atau dengan fase gerak didapatkan bahwa senyawa sudah terelusi pada sekitar menit ke-2. Artinya bahwa interaksi inter dan intra molekular
senyawa uji dengan eluen lebih kuat dibanding dengan fase diam. Niessen 2006 menjelaskan bahwa dalam sistem kromatografi fase terbalik interaksi ikatan
hidrogen senyawa uji polar terhadap fase diam sangat lemah dibanding ikatannya dengan eluen. Lebih lanjut Niessen 2006 menyatakan bahwa retensi senyawa uji
polar pada kromatografi fase terbalik akan makin menurun dengan makin meningkatnya polaritas senyawa uji.
58
O O
H OH
OH OH
OH O
Na
Electrospray Ionization Time of Flight Mass Spectrometry HPLC-ESI-TOF-MS
mode ion positif dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14. Spektra massa eluat kedua ekstrak metanol S. echinocarpum
Gambar 14 memperlihatkan bahwa eluat kedua ekstrak rumput laut coklat S. echinocarpum mempunyai mz dominan pada 288,2715. Berat molekul analat
ini menunjukkan suatu dimer floroglusinol dengan rumus molekul C
12
H
10
O
7
. Gross 2004 menyatakan ion yang terbentuk dari metode electrospray ionization
ESI sangat tergantung pada polaritas analat dan karakteristik pelarut. Berdasar waktu retensi analat dengan HPLC menunjukkan bahwa senyawa uji ini adalah
senyawa polar. Gross 2004 menyatakan bahwa ion yang terbentuk dari suatu senyawa polar pada sistem ESI mode ion positif akan berupa [M+Na]
+
Gambar 15. Struktur senyawa eluat kedua . Bila
digambarkan struktur senyawa ekstrak metanol terlihat pada Gambar 15.
Berdasar rumus molekul senyawa C
12
H
10
O
7
mz
yang kehilangan proton dan diganti dengan ion Na, maka akan didapat berat molekul senyawa sebesar 266.
Artinya senyawa dalam ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dinyatakan sebagai bifuhalol. Nakai et al. 2006 mendapati ekstrak metanol S.
ringgoldianum berstruktur oligomer dari bifuhalol. Singh dan Bharate 2006
59
-6 -4
-2 2
4 6
8 10
12 14
16
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10 11 12 13 14
Lama hari
K ena
ika n be
ra t ba
da n
0 mgkg 625 mgkg
1250 mgkg 2500 mgkg
5000 mgkg
menyatakan bahwa bifuhalol adalah senyawa turunan floroglusinol atau dimer floroglusinol yang berberat molekul 266 Da.
Berdasar analisis spektrometrik ultra ungu, infra merah dan spektra massa di atas maka dapat disimpulkan bahwa senyawa yang terkandung dalam eluat kedua
ekstrak metanol S. echinocarpum adalah bifuhalol. Berarti secara keseluruhan ekstrak metanol S. echinocarpum mengandung floroglusinol dan bifuhalol.
4.3 Toksisitas Akut
