Vasorelaksasi Karaki dan Sudjarwo, 1993 Dosis efektif 50 ED

42 dilakukan pembuatan larutan 1,5 mL H 2 O 2 dalam 150 mL metanol, dan sediaan kemudian dimasukkan ke dalam larutan tersebut. Kembali sediaan disimpan dalam air mengalir, kemudian ke dalam milliQ dan dicuci dengan Phosphate Buffer Saline PBS. Langkah selanjutnya adalah pemberian Bovine Serum Albumin BSA pada sediaan sebanyak 50-60 µL, diinkubasi pada suhu 37 o C selama 60 menit, lalu dicuci kembali dengan larutan PBS. Antibodi yang diberikan pada pewarnaan imunohistokimia ini adalah antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD dengan tingkat pengenceran 1:200 sebanyak 50-60 µL tergantung besarnya preparat dan sediaan disimpan dalam lemari es selama dua malam. Keluar dari lemari es, sediaan dicuci tiga kali dengan larutan PBS. Selanjutnya dilakukan pemberian antibodi kedua, yaitu Dako Envision Peroxidase System dalam jumlah yang sama dan kemudian diinkubasikan pada suhu 37 o Aorta yang endoteliumnya masih utuh diambil dan dicuci serta dipisahkan dari jaringan lemak. Aorta selanjutnya dipotong dalam bentuk cincin dengan C. Setelah dicuci dengan PBS, sediaan dimasukkan ke dalam larutan Diamino Benzidine DAB dalam Tris buffer sambil diperiksa di bawah mikroskop. Untuk perbandingan dengan reaktif negatif dilakukan counter stain dengan haematoxylin. Langkah akhir pewarnaan ini seperti halnya pada pewarnaan HE, yaitu dehidrasi, clearing dan mounting. Pengamatan perubahan morfologi menggunakan mikroskop cahaya yang dilengkapi dengan alat foto. Parameter yang diamati meliputi perubahan morfologi dan perubahan kandungan Cu,Zn-SOD pada kondisi hiperglikemik dan kemudian membandingkannya dengan kontrol. Perhitungan terhadap sebaran enzim antioksidan Cu,Zn-SOD ditentukan berdasarkan pada reaksi enzim antioksidan tersebut dengan antibodi Cu,Zn-SOD pada pembesaran 400X. Tiap bagian sampel masing-masing diwakili oleh sediaan serial dan perhitungan dilakukan pada tiga lapang pandang yang diambil secara acak. Pada pengamatan dilakukan pembagian kelompok berdasarkan intensitas reaksi yang terjadi yaitu: positif kuat +++, positif sedang ++, positif lemah +- , dan negatif -.

3.5.10 Vasorelaksasi Karaki dan Sudjarwo, 1993

43 panjang sekitar 3 mm dan diinkubasikan ke dalam isolated organ bath yang berisi larutan Krebs. Larutan Krebs dibuat dari NaCl 136,9 mM, KCl 5,4 mM, CaCl 2 1,5 mM, MgCl 2 1,0 mM, NaHCO 3 23,8 mM, EDTA 0,01 mM dan glukosa 5,5 mM. Tiap cincin aorta dikaitkan pada sepasang logam stainless steel berbentuk “S” dan dibenamkan dalam 10 mL larutan Krebs yang ditempatkan pada organ bath . Larutan Krebs dalam organ bath suhunya dipertahankan pada 37 o C dan terus diaerasi dengan campuran gas oksigen 95 dan karbondioksida 5. Salah satu ujung aorta difiksasi pada kait yang terdapat pada organ bath, sedangkan ujung yang lain dihubungkan dengan lever transduser Grass FT 0.3, Quincy, MA yang terhubung dengan amplifier dan rekorder untuk mencatat relaksasi dan kontraksi aorta yang terjadi. Lever diberi beban 2,0 ± 0,5 g bertujuan membentuk tegangan optimal untuk menginduksi kontraksi maksimal. Cincin tersebut dikondisikan dalam larutan Krebs selama 90 menit, tiap 15 menit larutan tersebut diganti. Tegangan isometrik cincin aorta ditampilkan dalam sistem akuisisi data Power Lab system 400, ML 118, ADInstruments, Medford, MA. Setelah masa pengkondisian, cincin aorta diinduksi untuk berkontraksi dengan menambahkan 0,1 mL 10 -4 kontraksi relaksasi M fenilefrin. Sesaat puncak kontraksi tercapai terlihat stabil, cincin aorta dipajan dengan asetilkolin 30 nM. Kondisi tersebut diulang kembali hingga pemberian asetilkolin 0,3 mM. Kontraksi dan relaksasi aorta diamati pada monitor komputer berperangkat lunak PowerLab. Respons dinyatakan sebagai persen relaksasi terhadap kontraksi yang diinduksi fenilefrin. Besarnya penglepasan EDRF dihitung berdasarkan rumus: Persentase penglepasan EDRF = x 100

3.5.11 Dosis efektif 50 ED

50 Nilai ED Foreman and Johansen, 2003 50 menunjukkan 50 penglepasan EDRF maksimal oleh sel endotelium akibat pemberian dosis kumulatif asetilkolin. Nilai ini diambil secara grafik hubungan antara besarnya konsentrasi agonis terhadap persentase vasorelaksasi dengan perangkat lunak statistik GraphPad Prism versi 5. Nilai ED 50 asetilkolin adalah dosis asetilkolin yang menimbulkan efek relaksasi pada 44 aorta tikus terisolasi dan dinyatakan sebagai nilai sensitivitas reseptor terhadap agonisnya.

3.5.12 Rasio sel endotelium