Sebanyak masing-masing 0.05 ml sampel dimasukkan ke dalam 2 buah tabung reaksi. Tabung reaksi pertama ditambah larutan buffer potasium klorida 0.025 M
pH 1 sebanyak 4.95 ml dan tabung reaksi kedua ditambahkan larutan buffer sodium asetat 0.4 M pH 4.5 sebanyak 4.95 ml. Pengaturan pH dalam pembuatan
buffer potasium klorida dan sodium asetat menggunakan HCl pekat. Absorbansi dari kedua perlakuan pH diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 515 nm dan 700 nm setelah didiamkan selama 15 menit. Nilai absorbansi dihitung dengan rumus : A = [A
515
– A
700 pH 1
– A
515
– A
700 pH
4.5
]. Konsentrasi antosianin dihitung sebagai sianidin-3-glikosida menggunakan
koefisien ekstingsi molar sebesar 29 600 L cm
-1
dan berat molekul sebesar 448.8. Konsentrasi antosianin mgL = A x BM x FP x 1000
ε x 1, dimana A adalah absorbansi, BM adalah berat molekul 448.8, FP adalah faktor pengenceran 5 ml
0.05 ml, dan ε adalah koefisien ekstingsi molar 29 600 L cm
-1
.
3.3.5.3 Rendemen Pigmen Antosianin Sari et al. 2005
Rendeman antosianin dihitung dalam persen yang menyatakan banyaknya antosianin yang terdapat dalam sampel berdasarkan berat basah.
Rendemen antosianin =
100 ×
g sampel
berat g
antosianin i
Konsentras
3.3.5.4 Pengukuran Warna dengan Spektofotometer
Pengukuran absorbansi dilakukan untuk ekstrak antosianin duwet dengan penambahan buffer dan ekstrak antosianin buah duwet. Absorbansi sampel diukur
dengan spektofotometer pada panjang gelombang maksimum antosianin. Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 520 nm.
3.3.5.5 Analisis Warna dengan Kromameter Francis, 1998
Pengukuran warna pada ekstrak tanpa dan dengan kopigmen yang dilarutkan pada buffer pH 3 dilakukan dengan alat Minolta Chroma Meters CR-
310. Prinsip dari Minolta Chroma Meters adalah pengukuran perbedaan warna melalui pantulan cahaya oleh permukaan sampel. Pengukuran dilakukan dengan
meletakkan sampel di dalam wadah sampel barukuran seragam dan selanjutnya dilakukan pengukuran pada skala nilai L, a, b, dan
o
h. Nilai L menyatakan
parameter kecerahan lightness yang mempunyai nilai dari 0 hitam sampai 100 putih. Nilai a menyatakan cahaya pantul yang menghasilkan warna kromatik
campuran merah-hijau dengan nilai +a positif dari 0 – 100 untuk warna merah dan nilai –a negatif dari 0- -80 untuk warna hijau. Notasi b menyatakan warna
kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +b positif dari 0 – 70 untuk kuning dan nilai –b negatif dari 0--70 untuk warna biru. Hue diperoleh dari tan
-1
ab, nilai hue ini berkisar antara 0 – 360
o
. Nilai ΔE merupakan parameter terjadinya
perubahan warna antosianin secara keseluruhan. Nilai ΔE dihitung dengan
persamaan: ΔE = [ΔL
2
+ Δa
2
+ Δb
2
]
12
Gambar 5. Pola kromasitas warna Anonim, 2005
3.3.5.6 Kinetika Degradasi Antosianin terhadap Suhu Pemanasan
Kinetika degradasi antosianin pada ekstrak dilakukan dengan uji estimasi kurva regresi antara hubungan retensi warna dengan lama pemanasan. Kinetika
degradasi antosianin secara umum berlangsung pada ordo ke-1 Calvi dan Francis, 1978; Ahmed et al. 2000; Cho et.al., 2001; Ozkan et al., 2002; Maarit, 2005.
Persamaan reaksi pada ordo ke-1 dapat dilihat pada persamaan sebagai berikut:
