BAHAN DAN ALAT Tempat dan Waktu Rancangan Percobaan Ekstraksi dan Karakteristik Ekstrak Pigmen Antosianin Buah Duwet Syzygium cumini

III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 BAHAN DAN ALAT

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah duwet yang diperoleh dari Jember Jawa Timur. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah etanol, aquadest, buffer potasium klorida, buffer sodium asetat, H 2 O 2 , HCl 37, NaOH, DMSO, natrium benzoat, asam ferulik dan asam galat. Alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca, hand blender, hidrolic press, stirer, sentrifus, penyaring vakum, rotary vakum evaporator, freeze drying, vortek, water bath, pH meter, lampu UV, termometer, mikropipet, spektrofotometer dan khromameter.

3.2 Tempat dan Waktu

Penelitian berlangsung dari bulan Maret 2007 sampai Juni 2008. Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Pangan, Biokimia, laboratorium Teknologi Pengolahan Departemen ITP-IPB dan laboratorium Kimia Fakultas MIPA-IPB.

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam dua tahapan, yaitu mencari metode ekstraksi dan bagian buah yang mengandung konsentrasi antosianin tertinggi dan pengujian stabilitas antosianin terpilih. Pada tahap pertama dilakukan pengukuran total rendemen ekstrak, konsentrasi antosianin dan rendemen antosianin pada dua bagian buah duwet yaitu kulit buah duwet dan buah duwet utuh tanpa biji. Penelitian dilanjutkan ke tahap kedua yang mengukur stabilitas ekstrak antosianin buah duwet terhadap berbagai faktor yaitu: tingkatan pH, oksidator, cahaya, suhu pemanasan, dan penyimpanan, selain itu pada tahap ini juga dilakukan upaya penstabilan pigmen antosianin dengan proses kopigmentasi dengan asam galat dan asam ferulik.

3.3.1 Persiapan Buah Duwet

Buah duwet yang digunakan adalah buah duwet yang berwarna ungu sangat matang. Buah duwet dipisahkan dari bijinya sehingga diperoleh kulit- daging buah buah duwet utuh tanpa biji, sedangkan sebagian buah duwet diambil kulitnya saja dengan menggunakan pisau stainless steel sehingga diperoleh kulit buahnya saja. Kulit buah dan buah duwet utuh tanpa biji secara terpisah diblansir selama 2 menit dengan menggunakan uap panas 80 o C untuk mengaktifkan enzim polifenol oksidase. Sampel yang diperoleh dimasukkan ke dalam kantong plastik dan disimpan dalam lemari pembeku untuk tahapan selanjutnya.

3.3.2 Optimasi Ekstraksi Antosianin.

Buah duwet diekstraksi dengan menggunakan 2 perlakuan, yaitu: Bagian Buah duwet yang diekstraksi A A1 = kulit buah duwet A2 = kulit dan daging buah duwet buah duwet utuh tanpa biji Metode ekstraksi B B1 = Pengepresan B2 = Maserasi dengan pelarut etanol B3 = Kombinasi pengepresan dan maserasi dengan pelarut etanol Dengan kombinasi: A1B1 A1B2 A1B3 A2B1 A2B2 A2B3 Ekstraksi dilakukan pada suhu ruang. Masing-masing sebanyak 50 gram kulit dan daging buah duwet diblender secara terpisah sebelum diekstraksi dengan tujuan mengecilkan ukuran sehingga dihasilkan sampel dalam bentuk bubur. Metode ektraksi dengan cara pengepresan dilakukan dengan cara mengepres bubur buah sehingga dihasilkan filtrat. Sedangkan, untuk ekstraksi menggunakan metode maserasi menggunakan metode yang pernah dilakukan oleh Sari et al. 2005 dengan menggunakan pelarut etanol, bubur buah di ekstraksi dengan pelarut etanol 100ml selama 60 menit. Larutan disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm untuk memisahkan filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh ditampung dalam erlenmeyer, dan residu diekstrak kembali dengan cara yang sama. Filtrat dari hasil maserasi dengan pelarut etanol yang diperoleh digabung, kemudian difiltrasi dengan vakum filter, dan dievaporasi dengan rotary vacumm evaporator pada suhu 36 o C, sehingga menghasilkan ekstrak pekat dan di keringkan dengan freeze drying. Untuk ekstraksi dengan menggunakan metode kombinasi pengepresan dan maserasi, sampel berupa bubur buah dipres sehingga menghasilkan filtrat dan residu, kemudian residu diekstraksi kembali dengan metode maserasi dengan menggunakan pelarut etanol sesuai dengan metode sebelumnya, filtrat yang diperoleh dari hasil pengepresan dan ekstraksi dengan pelarut etanol digabungkan dalam erlenmeyer, dievaporasi dan kemudian dikeringkan dengan freeze drying. Setelah dikeringkan, ekstrak yang diperoleh diukur total rendemen ekstrak, konsentrasi antosianin menggunakan metoda pH- differential Prior et al., 1998 dan rendemen pigmen antosianin.

3.3.3 Karakterisasi Pigmen Antosianin Kulit Buah Duwet pada Beberapa Variasi pH

Ekstrak kulit buah duwet dianggap sebagai antosianin Petunidin-3- rhamnosa BM = 463, yang didasarkan dari penelitian sebelumnya oleh Leimena 2008. Karakteristik antosianin ekstrak buah duwet dalam beberapa variasi pH dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak dianggap sebagai petunidin-3- rhamnosa dalam buffer potasium klorida 0.06 M untuk pH 1 sampai 4 dan buffer sodium asetat 0.06 M untuk pH 5 sampai 8 dengan konsentrasi 0.6mM. Larutan antosianin dicampur dengan perbandingan 1:1 dengan buffer pH masing- masing, sehingga konsentrasi akhir larutan antosianin adalah 0.3mM. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur pHnya menjadi pH 1 sampai 8 dengan 10M HCl atau 25 NaOH dan didiamkan selama 30 menit. Pengujian karakteristik antosianin dengan penambahan asam ferulik dan asam galat sebagai kopigmen dilakukan dengan melarutkan antosianin dalam potasium klorida 0.06 M untuk pH 1 sampai 4 dan buffer sodium asetat 0.06 M untuk pH 5 sampai 8 dengan konsentrasi 0.6mM. Kopigmen asam ferulik dilarutkan dalam 30 DMSO dalam masing-masing buffer dengan konsentrasi 0.06M Lampiran 1, sedangkan asam galat dilarutkan dalam 10 DMSO dalam masing-masing buffer dengan konsentrasi 0.06M. Larutan antosianin dan kopigmen dicampur dengan perbandingan 1:1, sehingga konsentrasi akhir larutan campuran adalah 0.3mM antosianin dan 0.03M kopigmen, sehingga perbandingan molar kedua larutan 1:100. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur pHnya menjadi pH 1 sampai 8 dengan 10 M HCl atau 25 NaOH dan didiamkan selama 30 menit. Metode kopigmentasi ini didasarkan pada metode yang digunakan oleh Maarit et al. 2002 yang dimodifikasi. Spektra UV-visibel larutan antosianin pada setiap nilai pH diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 sampai 650 nm untuk melihat pergeseran panjang gelombang maksimum. Perubahan nilai absorbansi akibat perlakuan pH juga diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum max pigmen antosianin buah duwet Sari et al. 2005.

3.3.4 Uji Stabilitas dan Kopigmentasi Pigmen Antosianin Buah Duwet Terpilih

Pengujian stabilitas terhadap oksidator, cahaya, suhu pemanasan dan penyimpanan dilakukan pada buffer pH 3 untuk antosianin dari ekstrak buah duwet tanpa dan dengan penambahan asam ferulik dan asam galat sebagai kopigmen untuk mempertahankan kestabilan warna antosianin. Ekstrak kulit buah duwet dianggap sebagai antosianin Petunidin-3- rhamnosa BM = 463, yang didasarkan dari penelitian sebelumnya oleh Leimena 2008. Pengujian stabilitas antosianin ekstrak buah duwet dilakukan dengan cara melarutkan ekstrak dianggap sebagai petunidin-3-rhamnosa dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.6mM. Larutan antosianin dicampur dengan perbandingan 1:1 dengan buffer KCl 0.06M, sehingga konsentrasi akhir larutan antosianin adalah 0.3mM. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur pHnya menjadi pH 3 dengan 10M HCl atau 25 NaOH. Pengujian antosianin dengan penambahan asam ferulik dan asam galat sebagai kopigmen dilakukan dengan melarutkan antosianin dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.6mM. Kopigmen asam ferulik dilarutkan dalam 30 DMSO dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.06M Lampiran 1, sedangkan asam galat dilarutkan dalam 10 DMSO dalam buffer KCl 0.06M dengan konsentrasi 0.06M. Larutan antosianin dan kopigmen dicampur dengan perbandingan 1:1, sehingga konsentrasi akhir larutan campuran adalah 0.3mM antosianin dan 0.03M kopigmen, sehingga perbandingan molar kedua larutan 1:100. Kemudian larutan yang telah dicampur diatur pHnya menjadi pH 3 dengan 10M HCl atau 25 NaOH. Metode kopigmentasi ini didasarkan pada metode yang digunakan oleh Maarit et al. 2002 yang dimodifikasi. pH 3 dipilih untuk analisis karena antosianin lebih stabil pada pH 3 dibanding dengan pH asam lainnya pH 1, 2, 4 dan 5, dan pH 3 umumnya merupakan pH untuk produk pangan asam seperti juice dan minuman berkarbonasi, sehingga dapat menggambarkan penerapannya dalam produk pangan. Pengujian stabilitas antosianin buah duwet dilakukan dengan melihat karakteristik terhadap beberapa variasi pH, serta mengukur kestabilannya terhadap oksidator, cahaya, suhu pemanasan, dan kondisi penyimpanan suhu dingin dan suhu ruang,. Stabilitas digambarkan dalam retensi warna atau pigmen yang dihitung dengan menggunakan persamaan: BA × 100, dimana A adalah nilai absorbansi antosianin sebelum diberi perlakuan dan B adalah nilai absorbansi antosianin setelah diberi perlakuan.

3.3.4.1 Stabilitas terhadap Oksidator

Larutan antosianin ekstrak dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen ditambah 0.25 ml H 2 O 2 1 volume akhir larutan dijaga tetap 10ml dimasukkan ke dalam botol gelap dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer = 520 nm serta dilakukan juga pengukuran dengan khromameter pada setiap waktu kontak 0, 3, 6, 9, 12 dan 15 jam.

3.3.4.2 Stabilitas terhadap Sinar

Larutan antosianin ekstrak dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen dimasukkan ke dalam botol gelap dan botol bening kemudian disinari dengan 2 lampu UV 40 watt intensitas sinar 2500 lux dalam wadah kotak selama 7 hari. Pengukuran absorbansi dilakukan setiap hari dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm dan dengan khromameter.

3.3.4.3 Stabilitas terhadap Suhu Pemanasan

Larutan antosianin tanpa kopigmen dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen dimasukkan ke dalam botol gelap dan diinkubasi pada suhu 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, dan 100 o C, selama 2 jam kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum antosianin kulit buah duwet pada pH 3 dan juga dengan khromameter setiap interval waktu 30 menit.

3.3.4.4 Pengaruh Suhu Selama Penyimpanan

Larutan antosianin ekstrak dan larutan antosianin ekstrak yang telah ditambah kopigmen dimasukkan ke dalam botol gelap dan disimpan pada suhu kamar 30 o C dan suhu dingin 10°C, selama 1 bulan. Kemudian dilakukan pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm dan dengan khromameter dengan interval waktu pengamatan 0, 5, 10, 15, 20, 25 dan 30 hari.

3.3.5 Metode Analisis

Pengamatan meliputi analisis total rendemen, konsentrasi antosianin, rendemen antosianin, dan analisis warna dengan khromameter .3.3.5.1 Total Rendemen Ekstrak Sari et al. 2005 Total rendemen dihitung dalam persen sebagai berat ekstrak yang telah dikeringkan dengan frezee dryer dibagi berat buah duwet basah. Total Rendemen = 100 ker × g duwet buah Berat g ing ekstrak Berat

3.3.5.2 Konsentrasi Antosianin dengan Metoda pH-differential Prior et al.

1998. Konsentrasi antosianin diukur dengan melarutkan ekstrak kering dalam pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan ditera sampai volume 25 ml. Sebanyak masing-masing 0.05 ml sampel dimasukkan ke dalam 2 buah tabung reaksi. Tabung reaksi pertama ditambah larutan buffer potasium klorida 0.025 M pH 1 sebanyak 4.95 ml dan tabung reaksi kedua ditambahkan larutan buffer sodium asetat 0.4 M pH 4.5 sebanyak 4.95 ml. Pengaturan pH dalam pembuatan buffer potasium klorida dan sodium asetat menggunakan HCl pekat. Absorbansi dari kedua perlakuan pH diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm dan 700 nm setelah didiamkan selama 15 menit. Nilai absorbansi dihitung dengan rumus : A = [A 515 – A 700 pH 1 – A 515 – A 700 pH 4.5 ]. Konsentrasi antosianin dihitung sebagai sianidin-3-glikosida menggunakan koefisien ekstingsi molar sebesar 29 600 L cm -1 dan berat molekul sebesar 448.8. Konsentrasi antosianin mgL = A x BM x FP x 1000 ε x 1, dimana A adalah absorbansi, BM adalah berat molekul 448.8, FP adalah faktor pengenceran 5 ml 0.05 ml, dan ε adalah koefisien ekstingsi molar 29 600 L cm -1 .

3.3.5.3 Rendemen Pigmen Antosianin Sari et al. 2005

Rendeman antosianin dihitung dalam persen yang menyatakan banyaknya antosianin yang terdapat dalam sampel berdasarkan berat basah. Rendemen antosianin = 100 × g sampel berat g antosianin i Konsentras

3.3.5.4 Pengukuran Warna dengan Spektofotometer

Pengukuran absorbansi dilakukan untuk ekstrak antosianin duwet dengan penambahan buffer dan ekstrak antosianin buah duwet. Absorbansi sampel diukur dengan spektofotometer pada panjang gelombang maksimum antosianin. Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 520 nm.

3.3.5.5 Analisis Warna dengan Kromameter Francis, 1998

Pengukuran warna pada ekstrak tanpa dan dengan kopigmen yang dilarutkan pada buffer pH 3 dilakukan dengan alat Minolta Chroma Meters CR- 310. Prinsip dari Minolta Chroma Meters adalah pengukuran perbedaan warna melalui pantulan cahaya oleh permukaan sampel. Pengukuran dilakukan dengan meletakkan sampel di dalam wadah sampel barukuran seragam dan selanjutnya dilakukan pengukuran pada skala nilai L, a, b, dan o h. Nilai L menyatakan parameter kecerahan lightness yang mempunyai nilai dari 0 hitam sampai 100 putih. Nilai a menyatakan cahaya pantul yang menghasilkan warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai +a positif dari 0 – 100 untuk warna merah dan nilai –a negatif dari 0- -80 untuk warna hijau. Notasi b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +b positif dari 0 – 70 untuk kuning dan nilai –b negatif dari 0--70 untuk warna biru. Hue diperoleh dari tan -1 ab, nilai hue ini berkisar antara 0 – 360 o . Nilai ΔE merupakan parameter terjadinya perubahan warna antosianin secara keseluruhan. Nilai ΔE dihitung dengan persamaan: ΔE = [ΔL 2 + Δa 2 + Δb 2 ] 12 Gambar 5. Pola kromasitas warna Anonim, 2005

3.3.5.6 Kinetika Degradasi Antosianin terhadap Suhu Pemanasan

Kinetika degradasi antosianin pada ekstrak dilakukan dengan uji estimasi kurva regresi antara hubungan retensi warna dengan lama pemanasan. Kinetika degradasi antosianin secara umum berlangsung pada ordo ke-1 Calvi dan Francis, 1978; Ahmed et al. 2000; Cho et.al., 2001; Ozkan et al., 2002; Maarit, 2005. Persamaan reaksi pada ordo ke-1 dapat dilihat pada persamaan sebagai berikut: kA dt dA = − Penentuan variabel kuantitatif degradasi antosianin dilakukan melalui integrasi terhadap persamaan tersebut hingga diperoleh persamaan matematis. Melalui persamaan matematis tersebut dapat diinterpretasikan nilai konstanta degradasi antosianin Singh, 1994. Persamaan matematis tersebut adalah: ∫ ∫ − − = t At A dt k A dA Ln At - ln Ao = -kt Ln AtA = -kt + C Ln Retensi Warna = -kt + C Keterangan: At = konsentrasi antosianin setelah pemanasan A = konsentrasi antosianin sebelum pemanasan k = konstanta degradasi antosianin t = waktu pemanasan Parameter besarnya ketergantungan laju reaksi terhadap suhu dapat dilihat dalam nilai energi aktivasinya Lund, 1977. Hal ini dapat dinyatakan dalam persamaan Arrhenius berikut: k = ko.e -EaRT ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ − = T R Ea ko k 1 ln ln Dimana: k = konstanta laju reaksi ko = faktor frekuensi Ea = energi aktivasi R = tetapan gas 1,987 kalmol.K atau 8,3145 Jmol.K T = suhu mutlak o C + 273 o K

3.4 Rancangan Percobaan

Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap RAL secara faktorial terdiri dari dua faktor dengan tiga kali ulangan. Adanya perbedaan yang diperoleh akan diuji lanjut dengan uji BNT pada taraf uji 5. Y ijk = + α i + β j + αβ ij + ε ijk Dimana: Yijk = nilai pengamatan akibat faktor A taraf ke i faktor B taraf ke j dan ulangan ke k = rata-rata α i = pengaruh utama faktor A β j = pengaruh utama faktor B αβ ij = pengaruh interaksi faktor A dan faktor B ε ijk = pengaruh acak yang menyebar normal 0, σ 2 IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Ekstraksi dan Karakteristik Ekstrak Pigmen Antosianin Buah Duwet Syzygium cumini

Pigmen antosianin buah duwet diperoleh melalui proses ekstraksi. Ekstraksi adalah suatu cara untuk memisahkan campuran beberapa zat menjadi komponen yang terpisah berdasarkan perbedaan kelarutannya, dengan melarutkan bahan dalam pelarut tertentu, baik pelarut polar maupun nonpolar. Untuk mengekstrak zat warna diperlukan metode yang sesuai dengan sifat bahan agar dihasilkan rendemen dan stabilitas yang tinggi Winarno 1997; Hanum 2000. Pada penelitian ini dilakukan proses ekstraksi menggunakan 3 metode yaitu dengan cara maserasi dengan pelarut etanol, metode pengepresan dan metode kombinasi pengepresan-maserasi. Pemilihan metode pengepresan ini didasarkan pada kepraktisan dan keamanan penerapannya. Sedangkan pemilihan etanol sebagai pelarut disesuaikan dengan kepolaran antosianin. Menurut Jackman dan Smith 1996, antosianin memiliki cincin aromatik yang mengandung gugus polar hidroksil, karboksil, metoksil dan residu glikosil yang menghasilkan molekur polar. Dengan keadaannya yang polar, antosianin lebih mudah larut dalam pelarut polar seperti etanol. Penggunaan etanol sebagai pelarut juga dipilih berdasarkan pertimbangan keamanan, karena tidak bersifat toksik sehingga relatif aman digunakan pada produk pangan. Hal ini didukung oleh Sari et al. yang melaporkan bahwa etanol merupakan salah satu pelarut yang efektif untuk ekstraksi antosianin dari buah duwet. Penambahan asam tidak dilakukan untuk menghindari kerusakan gugus asil. Menurut Markakis 1982, penambahan asam tidak selalu diperlukan untuk menghindari terhidrolisisnya gugus asil. Buah duwet yang digunakan sebagai bahan baku berada dalam kondisi segar untuk diolah pada tahapan selanjutnya. Kualitas bahan baku sangat mempengaruhi hasil ekstraksi yang optimal. Pada ekstraksi antosianin dari buah duwet bahan baku yang digunakan dalam pembuatan ekstrak adalah buah duwet yang telah matang yang memiliki ciri-ciri berwarna ungu kehitaman dan berkualitas baik. Tingkat kematangan yang digunakan pada penelitian ini sesuai penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Leimena 2008, yang melaporkan bahwa buah duwet dengan tingkat kematangan tinggi yaitu dengan warna kulit ungu kehitaman memiliki kandungan antosianin paling besar. Gambar 6 Buah Duwet Syzygium cumini Proses ekstraksi pigmen antosianin buah duwet, dimulai dari pemisahan bagian yang akan diekstraksi. Dalam penelitian ini dilakukan ekstraksi pada kulit buah duwet dan buah duwet utuh tanpa biji untuk mengetahui bagian buah duwet yang menghasilkan konsentrasi antosianin terbanyak. Sampel yang sudah dipisahkan dari bagian yang tidak diperlukan diblansir dengan menggunakan uap panas. Menurut Hutching 1994, enzim yang dapat merusak antosianin dapat diaktivasi dengan menggunakan pemanasan. Bagian buah duwet dihancurkan terlebih dahulu untuk memperluas permukaan bahan sehingga laju pelarutan semakin tinggi. Proses ekstraksi pigmen antosianin pada buah duwet dilakukan dengan 3 cara pengepresan, maserasi menggunakan pelarut etanol dan kombinasi keduanya, ekstraksi dilakukan pada suhu ruang dan kondisi yang gelap. Hal ini dilakukan karena pada umumnya antosianin tidak stabil terhadap cahaya Sari et al. 2005. Adanya cahaya dapat menyebabkan degradasi pada antosianin Elbe dan Schwarts, 1996. Pada proses ekstraksi dengan metode maserasi dengan pelarut etanol dan kombinasi pres-maserasi, proses maserasi dilakukan sebanyak dua kali sehingga menghasilkan filtrat yang berwarna ungu pudar. Hal ini dilakukan untuk mengoptimumkan proses ekstraksi sehingga pigmen antosianin yang terdapat pada sampel bisa terekstrak seluruhnya. Pengadukan dengan stirrer dilakukan untuk menambah efektifitas dari proses ekstraksi tersebut. Setelah itu dilakukan proses sentrifugasi untuk memisahkan filtrat dengan ampas. Pada proses ekstraksi ini juga dilakukan penyaringan menggunakan vacuum filter untuk memisahkan sisa-sisa ampas yang ada setelah proses sentrifugasi. Filtrat yang dihasilkan kemudian dipekatkan dengan menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 36 o C. Penggunaan suhu yang rendah ini bertujuan untuk menghindari terjadinya degradasi dan hidrolisis dari pigmen antosianin Timberlake dan Bridle, 1983. Filtrat dipekatkan dengan cara menguapkan etanolnya. Filtrat yang telah dipekatkan kemudian ditambah aquadest dan dipekatkan kembali. Ekstrak kasar yang diperoleh kemudian dimasukkan kedalam botol gelap dan disimpan dalam freezer. Penyimpanan dalam freezer sampai ekstrak digunakan untuk analisis berikutnya ini bertujuan menjaga stabilitas antosianin yang sangat mudah terdegradasi. Ekstrak pekat antosianin dapat dilihat pada Gambar 7. Gambar 7 Ekstrak kulit buah duwet Syzigium cumini Hasil ekstraksi dari berbagai macam variasi cara ekstraksi dan bagian buah yang diekstrak dalam penelitian ini diukur total rendemen, konsentrasi antosianin dan rendemen antosianinnya, dimana hasil dari bagian buah dan cara ekstraksi yang paling baik digunakan untuk penelitian selanjutnya. Kisaran total rendemen ekstrak buah duwet pada penelitian ini sebesar 6.6 hingga 11.55 Gambar 8. Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa metode ekstraksi memberikan pengaruh sangat nyata terhadap rendemen ekstrak dari bagian buah yang diekstraksi. Pada metode maserasi dan kombinasi pengepresan-maserasi, nilai total rendemen dari kulit dan daging buah duwet utuh tidak berbeda nyata Lampiran 3 dan 4. 11.55a 9.84b 8.58c 9.38b 11.48a 6.6d 2 4 6 8 10 12 14 Pres Mas erasi Pres -Maseras i Metode Ekstraksi T o ta l R e nd em e n Buah Duwet Utuh Tanpa Biji Kulit Buah Duwet Gambar 8 Total rendemen ekstrak Buah Duwet Ekstraksi buah duwet utuh tanpa biji dengan metode pengepresan-maserasi kombinasi menghasilkan total rendemen tertinggi sebesar 11,55 dan kulit buah duwet memberikan juga memberikan hasil yang tidak berbeda nyata yaitu sebesar 11,48 Lampiran 3. Hasil penelitian terdahulu oleh Sari et al. 2005 memperoleh rendemen antosianin kulit buah duwet yang diekstrak dengan pelarut etanol adalah sebesar 1,415. Perbedaan hasil ini diduga karena banyak zat yang ikut terekstrak pada air yang keluar saat pengepresan buah duwet utuh tanpa biji dan senyawa yang masih ada dalam ampas sisa pengepresan terekstrak kembali oleh etanol, sehingga sebagian besar komponen dalam buah duwet utuh tanpa biji dapat terekstrak. Hal ini juga menunjukkan bahwa etanol merupakan pelarut yang memiliki kepolaran yang sama dengan antosianin dalam ekstrak buah duwet. Menurut Cacace dan Mazza 2003, juga melaporkan bahwa etanol efektif untuk mengekstraksi antosianin dari black currants pada suhu ruang. Konsentrasi antosianin diukur dengan menggunakan metode pH differential . Total antosianin dihitung dari selisih pengukuran absorbansi sampel pada panjang gelombang maksimum yang dilarutkan masing-masing dalam dua macam larutan buffer yaitu buffer 1 dan buffer 4,5. Menurut metode Prior et al. 1998, pH 1, antosianin berada dalam bentuk kation flavilium yang dianggap mewakili jumlah antosianin dan senyawa-senyawa pengganggu. Sedangkan pada pH 4.5, antosianin berada dalam bentuk karbinol yang dianggap mewakili jumlah senyawa pengganggu. Selisih dari kedua pengukuran akan menunjukkan jumlah antosianin Francis, 1982. Gambar 9a menunjukkan histogram konsentrasi antosianin ekstrak dalam satuan mgg bagian buah dengan perlakuan bagian buah duwet yang diekstraksi dan metode ekstraksi. Pengukuran konsentrasi antosianin dilakukan pada bagian buah duwet utuh tanpa biji dan kulit buah duwet yang berwarna ungu kehitaman, yang diekstrak dengan metode pengepresan, maserasi dengan pelarut etanol dan kombinasi pengepresan-maserasi dengan etanol. Tingkat kematangan buah duwet yang dipakai pada penelitian ini dirujuk dari penelitian sebelumnya. Leimena 2008, menyatakan bahwa kandungan antosianin pada buah duwet yang sangat matang berwarna ungu kehitaman memiliki kandungan antosianin yang paling tinggi. Kombinasi pengepresan-maserasi merupakan metode ekstraksi yang menghasilkan kandungan antosianin tertinggi yaitu sebesar 3,89mgg kulit buah duwet. Terdapat perbedaan kandungan antosianin yang cukup besar antara kulit buah dan kulit dengan daging buah Lampiran 5. Berdasarkan hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa metode ekstraksi dan bagian buah duwet yang diekstraksi memberikan pengaruh sangat nyata terhadap konsentrasi antosianin begitu pula dengan interaksi antara kedua faktor tersebut Lampiran 6 dan Lampiran 7. 1.07e 1.37c 0.52f 1.24d 0.325b 3.89a 1 2 3 4 Pres Maserasi Pres-Maserasi Metode ekstraksi K o n sen tr as i an to si an in m g g a 0.052f 0.137c 0.107e 0.325b 0.124d 0.389a 0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 Pres Maserasi Pres-Maserasi Metode ekstraksi R en d em en an to si an in Buah Duwet Utuh Tanpa Biji Kulit Buah Duwet b Gambar 9 a Konsentrasi antosianin dan b Rendemen antosianin dari ekstrak buah Duwet Menurut MacDougall 2002, antosianin terdapat pada sel epidermal dan subepidermal, yang terlarut dalam vakuola atau terakumulasi pada gelembung yang disebut antosianoplas. Umumnya antosianin juga terdapat pada permukaan buah yaitu kulit buah. Rendemen antosianin pada kulit buah lebih besar bila dibandingkan dengan buah utuhnya. Hasil penelitian ini juga diperkuat oleh Leimena 2008 yang melaporkan bahwa kulit buah duwet yang diekstrak dengan cara maserasi dengan etanol menghasilkan konsentrasi antosianin sebesar 3,79 mgg. Pada cara ekstraksi kombinasi, pigmen antosianin ikut terekstrak pada air yang keluar saat pengepresan kulit buah duwet dan antosianin yang masih ada dalam ampas kulit duwet sisa pengepresan terekstrak kembali oleh etanol, sehingga sebagian besar antosianin dalam kulit buah duwet terekstrak. Etanol diduga memiliki polaritas yang sama dengan antosianin dalam kulit buah duwet. Oleh karena itu untuk analisis selanjutnya hanya digunakan kulit buah saja dengan cara ekstraksi kombinasi pengepresan-maserasi dengan etanol karena akan menghasilkan pigmen lebih tinggi. Rendemen antosianin kulit buah duwet sebesar 0,39 ini berarti jumlah antosianin dalam 100 gram kulit buah duwet adalah 389 miligram 3,89 mgg. Konsentrasi antosianin kulit buah duwet pada hasil penelitian ini memiliki nilai yang lebih besar dibandingkan dengan beberapa sumber-sumber lain yang mengandung antosianin seperti yang disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Konsentrasi antosianin dari beberapa komoditi buah. Buah Konsentrasi antosianin mgg bahan Blueberries Capulin Strawberry Plum Apel Elderberries Kulit anggur Kubis ungu 1,10-1,90 0,32 0,07-0,75 0,05 0,01-0,1 2-10 0,51 0,82 Bridle dan Timberlake 1997; Prior et al. 1998; Galindo et al. 1999; Leimena 2008 Hasil ini menunjukkan bahwa kandungan antosianin pada buah duwet khususnya bagian kulitnya sangat berpotensi besar untuk dijadikan sebagai sumber pigmen alami, sehingga dapat meningkatkan nilai manfaat dari buah duwet.

4.2 Karakterisasi Ekstrak Pigmen Antosianin Kulit Buah Duwet pada Beberapa Variasi pH