Penyediaan Sampel Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan N-Heksana Daun Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan N-HeksanaDaun Benalu Prosedur Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana

Bakteri Escherichia coli Bakteri Pseudomonas aeruginosa

2.5 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun benalu kakaoDendrophthoe pentandra L. Miq. yang diperoleh dari pohon kakao yang berada didaerah Kelurahan Barisan Pansur Nauli, Kecamatan Siantar Marihat, Kota Madya Siantar, Sumatera Utara. Daun benalu pohon kakao dipisahkan dari batang dan buahnya. Sampel dikeringkan dalam ruangan selama 5 hari kemudian dihaluskan dengan blender kemudian dihitung kadar airnya.

3.3.2 Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan N-Heksana Daun

Benalu Kakao Dendrophthoe pentandra L. Miq. Ditimbang serbuk daun benalu kakaoDendrophthoe pentandra L. Miq. sebanyak masing-masing 200 g, dimaserasi dengan 2 liter metanol destilat, etil asetat dan n-heksana selama 2x24 jam. Kemudian disaring. Dilakukan beberapa kali pengulangan hingga larutan berwarna jernih. Filtrat yang diperoleh dirotari evaporator dan ekstrak pekat metanol, etil asetat dan n-heksana yang diperoleh dipekatkan kembali pada penangas air sampai diperoleh ekstrak yang bebas dari pelarut metanol, etil asetat dan n-heksana dan ditimbang.

3.3.3 Uji Skrining Fitokimia

3.3.3.1 Uji Alkaloida

Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakaoDendrophthoe pentandra L. Miq. masing-masing dimasukkan dalam 4 tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Wagner, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloida. Tabung II ditetesi pereaksi Maeyer, jika terbentuk endapan putih, maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan cokelat, maka positif mengandung alkaloida dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloida.

3.3.3.2 Uji Flavonoida

Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksanadaun benalu kakao Dendrophthoepentandra L. Miq. masing-masing dimasukkan dalam 2 tabung reaksi. Tabung I ditetesi NaOH 10, jika terbentuk larutan warna biru violet maka positif mengandung flavonoida. Tabung II ditambah serbuk Mg dan HCl pekat, jika terbentuk larutan warna jingga maka positif mengandung flavonoida.

3.3.3.3 Uji Tanin

Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakaoDendrophthoe pentandra L. Miq. masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan FeCl 3 5. Jika terbentuk larutan warna biru kehitaman maka positif mengandung tanin.

3.3.3.4 Uji Terpenoida

Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakaoDendrophthoepentandra L. Miq. masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan CeSO 4 1 dalam H 2 SO 4 10. Jika terbentuk endapan warna merah kecokelatan maka positif mengandung terpenoida.

3.3.3.5 Uji Saponin

Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakaoDendrophthoepentandra L. Miq. masing-masing ditambah 10 ml aquades, kemudian dikocok kuat-kuat. Jika muncul busa yang stabil maka positif mengandung saponin.

3.3.4 Uji Sifat Antioksidan Daun Benalu Kakao Dendrophthoe pentandra

L. Miq. 3.3.4.1

Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mM Larutan DPPH 0,3 mM dibuat dengan melarutkan 11,85 g serbuk DPPH dengan etanol p.a dalam labu takar 100 ml, kemudian dihomogenkan.

3.3.4.2 Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan N-

Heksana Daun BenaluKakao Dendrophthoe pentandra L. Miq. Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao dibuat larutan induk 1000 ppm, dengan melarutkan 0,025 g ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian dari larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm. Dari larutan 100 ppm dibuat variasi konsentrasi 20 ppm, 40 ppm, 60 ppmdan 80 ppm untuk diuji aktivitas antioksidannya.

3.3.4.3 Uji Aktivitas Antioksidan

a. Uji Aktivitas Antioksidan Larutan Blanko

Sebanyak 2,5 ml etanol absolut ditambahkan 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dalam tabung reaksi, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap. Kemudian diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 515 nm.

b. Uji Aktivitas Antioksidan Sampel

Sebanyak 5 ml ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao Dendropthoe pentandra L. Miq. ditambahkan dengan 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dalam tabung reaksi, dihomogenkan dan dibiarkan dalam ruang gelap selama 30 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang maksimum 515 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 40, 60 dan 80 ppm.

3.3.4.4 Pembuatan Variasi Konsentrasi Vitamin C

Vitamin C dibuat larutan induk 1000 ppm, dengan melarutkan 0,025 g vitamin C dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian dari larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm. Dari larutan 100 ppm dibuat variasi konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm dan 20 ppm untuk diuji aktivitas antioksidannya.

3.3.4.5 Uji Aktivitas Antioksidan Vitamin C

Sebanyak 0,5 mg vitamin C ditambahkan dengan 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dalam tabung reaksi, dihomogenkan dan dibiarkan dalam ruang gelap selama 30 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang maksimum 515 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 10, 15 dan 20 ppm.

3.3.5 Uji Sifat Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana

Daun Benalu Kakao Dendrophthoe pentandra L. Miq.

3.3.5.1 Pembuatan Media NutrientAgar NA

Sebanyak 7 g nutrient agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit.

3.3.5.2 Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri

Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30-45 o . Biakan bakteri Staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi pada biakan bakteri.

3.3.5.3 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar MHA

Sebanyak 19 g serbuk Mueller Hinton Agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 500 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit.

3.3.5.4 Penyiapan Inokulum Bakteri

Sebanyak 3,25 g Nutrient Broth dilarutkan dengan 250 ml aquadestdalam erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih, kemudian disterilkan diautoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada suhu 35 ± 20 o C selama ± 3 jam, lalu dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar mcfarland. Hal yang sama juga dilakukan untuk koloni bakteriStaphylococcus aureusdan Escherichia coli.

3.3.5.5 Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-

Heksana Daun Benalu Kakao Dendrophthoe pentandra L. Miq. Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakaoDendrophthoe pentandra L. Miq. dibuat dalam berbagai konsentrasi dengan menimbang ekstrak masing-masing sebanyak 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg dan 500 mgkemudian dilarutkan masing-masing 1 ml DMSO. Konsentrasi ekstrak adalah 100 mgml, 150 mgml, 200 mgml, 300 mgml, 350 mgml, 400 mgml, 450 mgml dan 500 mgml.

3.3.5.6 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana

Daun Benalu Kakao Dendrophthoe pentandra L. Miq. Sebanyak 0,1 ml inokulum Staphylococcus aureus dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media Mueller Hinton Agar sebanyak 15 ml dengan suhu 45-50 o C dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata, kemudian dibiarkan sampai memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao dengan berbagai variasi konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 ± 2 o C selama 18 jam. Selanjutnya diukur diameter zona hambat di sekitar kertas cakram dengan jangka sorong. Dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Escherichia coli.

3.4 Bagan Penelitian

3.4.1 Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan N-HeksanaDaun Benalu

Kakao Dendrophthoe pentandra L. Miq. dipisahkan dari batangnya dikeringkan dalam ruangan selama 5 hari dihaluskan dengan blender ditimbang sebanyak masing-masing 200 gram dimaserasi dengan 2 liter metanol, etil asetat dan n-heksana selama 2 x 24 jam disaring diuapkan dengan rotarievaporator Uji Skrining Fitokimia dipekatkan kembali dengan penangas air hingga bebas dari pelarut ditimbang Daun Benalu Kakao Filtrat Residu Filtrat Ekstrak Pelarut Metanol, Etil Asetat dan N-Heksana Uji Aktivitas Antioksidan Uji Aktivitas Antibakteri

3.4.2 Prosedur Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana

Daun Benalu Kakao Dendrophthoe pentandra L. Miq. ditimbang sebanyak masing-masing 200 gram dimaserasi dimaserasi dimaserasi dengan 2 liter dengan 2 liter dengan 2 liter metanol selama etil asetat selama n-heksana selama 2x24 jam 2x24 jam 2x24 jam disaring disaring disaring Serbuk Daun Benalu Kakao sebanyak 200 g Serbuk Daun Benalu Kakao sebanyak 200 g Serbuk Daun Benalu Kakao sebanyak 200 g Ekstrak Metanol Daun Benalu Kakao Ekstrak Etil Asetat Daun Benalu Kakao Ekstrak n-Heksana Daun Benalu Kakao Serbuk Daun Benalu Kakao

3.4.3 Uji Skrining Fitokimia Daun Benalu Kakao Dendrophthoe pentandra