49 kalium sorbat; 1 ml tartrazin dan 0,5 ml sunset yellow LBCO. Kemudian 1 ml
LBCO dimasukkan ke dalam labu ukur 10 dan diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda sehingga diperoleh larutan
baku seri 10 LBS10.
3.9.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Tahap ini untuk menentukan panjang gelombang yang akan digunakan pada detektor KCKT. Pengukuran absorbansi dilakukan LBTS1 – LBTS5 dari masing-
masing senyawa. M asing-masing larutan diukur pada 190 - 600 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Spektrum yang diperoleh dianalisis untuk menentukan
panjang gelombang maksimum yang digunakan untuk analisis selanjutnya dari keenam senyawa tersebut.
3.9.3 Optimasi Metode KCKT
3.9.3.1 Optimasi Volume Void Tahap ini dilakukan untuk mengetahui volume void. Percobaan dilakukan
dengan menyaring larutan LBS10 dengan penyaring syringe PTFE 0,4 5 µm,
disonikasi selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan 5 µl LBS 10 ke dalam kolom
dengan menggunakan panjang gelombang 200 nm, laju alir 0,8 mlmenit, suhu kolom 30
o
C, komposisi campuran buffer fosfat dan metanol 75 : 25, pH fase gerak 4,5 dan volume void yang diuji adalah 20, 30 dan 40. Selanjutnya
dipilih kondisi yang memberikan hasil optimum. Parameter yang dipakai untuk menetapkan kondisi percobaan adalah faktor kapasitas k’.
Universitas Sumatera Utara
50 3.9.3.2 Optimasi Panjang Gelombang
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui panjang gelombang optimum. Percobaan dilakukan dengan menyaring larutan LBS10 dengan penyaring syringe
PTFE 0,4 5 µm, disonikasi selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan 5 µl LBS10 ke
dalam kolom dengan menggunakan volume void hasil optimasi, laju alir 0,8 mlmenit, suhu kolom 30
o
C, komposisi campuran buffer fosfat dan metanol 75 : 25, pH fase gerak 4,5 dan panjang gelombang yang diuji adalah 200 nm, 220 nm -
240 nm dan 440 nm - 470 nm dengan range 10 nm. Selanjutnya dipilih kondisi yang memberikan hasil optimum. Parameter yang dipakai untuk menetapkan
kondisi percobaan adalah faktor tailing tR’ dan tinggi serapan.
3.9.3.3 Optimasi pH Fase Gerak Tahap ini untuk memperoleh pH larutan buffer fosfat yang memberikan
pemisahan senyawa dengan baik. Percobaan dilakukan dengan menyaring larutan LBS10 dengan penyaring syringe PTFE 0,4
5 µm, disonikasi selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan 5
µl LBS10 ke dalam kolom dengan menggunakan volume void, panjang gelombang hasil optimasi, laju alir 0,8 mlmenit, suhu kolom 30
o
C, fase gerak campuran buffer fosfat dan metanol 75 : 25 dan pH fase gerak yang
diuji adalah 4,0; 4,3; 4,5 dan 4,7. Selanjutnya dipilih kondisi yang memberikan hasil optimum. Parameter yang dipakai untuk menetapkan kondisi percobaan
adalah waktu retensi, faktor kapasitas, faktor tailing, resolusi dan jumlah plat teoritis.
Universitas Sumatera Utara
51 3.9.3.4 Optimasi Komposisi Fase Gerak
Tahap ini untuk menentukan komposisi fase gerak optimum yang memberikan pemisahan senyawa dengan baik. Percobaan dilakukan dengan
menyaring larutan LBS10 dengan penyaring syringe PTFE 0,4 5 µm, disonikasi
selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan 5 µl LBS10 ke dalam kolom dengan
menggunakan volume void, panjang gelombang dan pH fase gerak hasil optimasi, laju alir 0,8 mlmenit dan suhu kolom 30
o
C. Komposisi campuran buffer fosfat dan metanol yang diuji adalah 73 : 27; 75 : 25 dan 77 : 23. Selanjutnya dipilih kondisi
yang memberikan hasil optimum. Parameter yang dipakai untuk menetapkan kondisi percobaan adalah waktu retensi, faktor kapasitas, faktor tailing, resolusi
dan jumlah plat teoritis.
3.9.3.5 Optimasi Laju Alir Tahap ini bertujuan untuk menentukan laju alir optimum yang memberikan
pemisahan senyawa dengan baik. Percobaan dilakukan dengan menyaring larutan LBS10 dengan penyaring syringe PTFE 0,4
5 µm, disonikasi selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan 5
µl LBS10 ke dalam kolom dengan menggunakan volume void, panjang gelombang, komposisi dan pH fase gerak hasil optimasi dengan suhu
kolom 30
o
C. Laju alir yang diuji adalah 0,8; 1,0 dan 1,2 mlmenit. Selanjutnya dipilih kondisi yang memberikan hasil optimum. Parameter yang dipakai untuk
menetapkan kondisi percobaan adalah waktu retensi, faktor kapasitas, faktor tailing, resolusi dan jumlah plat teoritis.
Universitas Sumatera Utara
52 3.9.3.6 Optimasi Suhu Kolom
Tahap ini bertujuan untuk menentukan suhu kolom optimum yang memberikan pemisahan senyawa dengan baik. Percobaan dilakukan dengan
menyaring larutan LBS10 dengan penyaring syringe PTFE 0,4 5 µm, disonikasi
selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan 5 µl LBS10 ke dalam kolom
menggunakan volume void, panjang gelombang, komposisi dan pH fase gerak dan laju alir hasil optimasi. Suhu kolom yang diuji adalah 25
o
C, 30
o
C dan 35
o
C. Selanjutnya dipilih kondisi yang memberikan hasil optimum. Parameter yang
dipakai untuk menetapkan kondisi percobaan adalah waktu retensi, faktor kapasitas, faktor tailing, resolusi dan jumlah plat teoritis.
3.9.4 Penentuan Waktu Retensi Senyawa
