52 3.9.3.6 Optimasi Suhu Kolom
Tahap ini bertujuan untuk menentukan suhu kolom optimum yang memberikan pemisahan senyawa dengan baik. Percobaan dilakukan dengan
menyaring larutan LBS10 dengan penyaring syringe PTFE 0,4 5 µm, disonikasi
selama 15 menit. Kemudian diinjeksikan 5 µl LBS10 ke dalam kolom
menggunakan volume void, panjang gelombang, komposisi dan pH fase gerak dan laju alir hasil optimasi. Suhu kolom yang diuji adalah 25
o
C, 30
o
C dan 35
o
C. Selanjutnya dipilih kondisi yang memberikan hasil optimum. Parameter yang
dipakai untuk menetapkan kondisi percobaan adalah waktu retensi, faktor kapasitas, faktor tailing, resolusi dan jumlah plat teoritis.
3.9.4 Penentuan Waktu Retensi Senyawa
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui waktu retensi setiap senyawa. Larutan LBT disaring dengan penyaring syringe PTFE 0,4
5 µm, disonikasi selama 15 menit. Penentuan waktu retensi dilakukan dengan menginjeksikan 5
µL LBT. Kondisi pengujian adalah volume void 30, suhu oven 30
o
C, fase gerak buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25, laju alir 1,0 mlmenit dengan tiga panjang
gelombang deteksi hasil optimasi. Waktu retensi setiap senyawa yang diperoleh merupakan karakteristik untuk identifikasi senyawa.
Universitas Sumatera Utara
53
3.9.5 Validasi Metode KCKT
Hasil optimasi metode kemudian divalidasi dengan parameter yang meliputi: linearitas, batas deteksi, batas kuantitasi, akurasi, presisi dan selektivitas.
3.9.5.1 Linearitas M asing-masing larutan baku seri LBS disaring dengan penyaring syringe
PTFE 0,2 µm dan disonikasi selama 15 menit. Larutan LBS1 diinjeksikan sebanyak 5 µL, kemudian dibiarkan sampai semua komponen keluar dan terpisah
dari kolom. Langkah tersebut diulangi dengan menginjeksikan 5 µl LBS1, LBS2,
LBS3, LBS4, LBS5, LBS6, LBS7, LBS8 dan LBS9. Kemudian diplot hubungan antara konsentrasi larutan baku X dengan luas area Y dari masing-masing
komponen, ditentukan persamaan linear Y = a + bX, dihitung koefisien korelasi r, batas deteksi LOD dan batas kuantitasi LOQ. Batas deteksi dan batas
kuantitasi masing-masing dihitung dengan persamaan LOD = 3SDb dan LOQ = 10SDb Ravichandran, et al., 2010; Chan, et al., 2004; Harmita, 2004; Huber,
1999.
3.9.5.2 Akurasi Uji kecermatan dilakukan dengan menggunakan metode penambahan
bahan baku standard addition method. Pengujian akurasi dilakukan pada rentang 80, 100 dan 120. Larutan sirup X LS dibuat dengan cara menimbang
sejumlah 5,0128 g sirup X, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml dan ditambah aqua bidestilata steril sampai garis tanda, sehingga dalam 1 ml larutan LS
mengandung 0,1003 gram sirup X.
Universitas Sumatera Utara
54 Untuk pengujian sirup dilakukan dengan memipet 1 ml LS, dimasukkan ke
dalam sebuah labu ukur 10 ml, diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda, disaring dengan penyaring syringe PTFE
0,4 5 µm, disonikasi selama 15 menit dan diinjeksikan 5 µl ke dalam alat KCKT
dengan kondisi sesuai hasil optimasi. Akurasi 80 dilakukan dengan penambahan 0,8 ml LBC ke dalam 1 ml
LS, dimasukkan ke dalam sebuah labu ukur 10 ml, diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda. Larutan tersebut
disaring dengan penyaring syringe PTFE 0,4 5 µm, disonikasi selama 15 menit dan
diinjeksikan 5 µl ke dalam alat KCKT dengan kondisi sesuai hasil optimasi.
Akurasi 100 dilakukan dengan penambahan 1 ml LBC ke dalam 1 ml LS, dimasukkan ke dalam sebuah labu ukur 10 ml, diencerkan dengan campuran buffer
fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda. Larutan tersebut disaring dengan penyaring syringe PTFE 0,4
5 µm, disonikasi selama 15 menit dan diinjeksikan 5
µl ke dalam alat KCKT dengan kondisi sesuai hasil optimasi. Akurasi 120 dilakukan dengan penambahan 1,2 ml LBC ke dalam 1 ml
LS, dimasukkan ke dalam sebuah labu ukur 10 ml, diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda. Larutan tersebut
disaring dengan penyaring syringe PTFE 0,4 5 µm, disonikasi selama 15 menit dan
diinjeksikan 5 µl ke dalam alat KCKT dengan kondisi sesuai hasil optimasi.
Perhitungan konsentrasi senyawa dalam larutan sirup X, akurasi 80, akurasi 100 dan akurasi 120 menggunakan persamaan regresi masing-masing
senyawa. Kemudian dihitung konsentrasi senyawa dalam sirup dengan menggunakan rumus M = cW x Fp1000 x k. Selisih konsentrasi senyawa dalam
Universitas Sumatera Utara
55 akurasi 80, 100 dan 120 dengan sirup X C
1
- C
2
dibandingkan dengan konsentrasi senyawa baku yang sebenarnya ditambahkan
C
3
. Hasil perhitungan
akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali, dihitung dengan persamaan persentase recovery sebesar [
C
1
- C
2
C
3
]x 100 Ravichandran, et al., 2010; Chan, et al., 2004; Harmita, 2004; Huber, 1999.
3.9.5.3 Presisi Uji keseksamaan dilakukan sebagai uji ripitabilitas URI dan uji
reprodusibilitas URE. Uji uji ripitabilitas dilakukan dengan cara menyuntikkan 8 µL LBS 10 sebanyak 6 kali ulangan pada kondisi sistem KCKT yang diperoleh
sesuai dengan hasil optimasi. Pengujian reprodusibilitas dilakukan dengan cara menyuntikkan 5
µL campuran larutan sirup X dengan LBC. Larutan sirup X LS dipipet 1 ml dan
dicampur dengan 1,2 ml LBC dalam labu ukur 10 ml dan diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda, disaring
dengan penyaring syringe PTFE 0,45 µm, disonikasi selama 15 menit dan
diinjeksikan 5 µl ke dalam alat KCKT dengan ulangan sebanyak 6 kali pada
kondisi sistem KCKT yang diperoleh sesuai dengan hasil optimasi. Data yang diperoleh setiap injeksi digunakan untuk menentukan
keterulangan metode dan ketertiruan metode yang dinyatakan sebagai persen RSD dari luas area. Dihitung standar deviasi SD, kadar rata-rata
X
dan persentase RSD sebesar SD
X
x 100 Ravichandran, et al., 2010; Chan, et al., 2004; Harmita, 2004; Burn, et al., 2002; Huber, 1999.
Universitas Sumatera Utara
56 3.9.5.4 Selektivitas
Uji selektivitas dilakukan dengan membandingkan kromatogram larutan baku, larutan sirup X dan larutan sirup X ditambah baku. Kromatogram larutan
baku, larutan sirup X dan larutan sirup X ditambah baku harus menunjukkan waktu retensi relatif sama dengan waktu retensi masing-masing senyawa. Kondisi
pengujian menggunakan metode KCKT sesuai hasil optimasi. Larutan sirup X ditambah baku dibuat sesuai prosedur pengujian 100
pada uji akurasi. Larutan sirup X ditambah baku dibuat dengan cara menambahan 1 ml LBC ke dalam 1 ml LS, dimasukkan ke dalam sebuah labu tentukur 10 ml,
diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda. Larutan tersebut disaring dengan penyaring syringe PTFE 0,4
5 µm, disonikasi selama 15 menit dan diinjeksikan 5
µl ke dalam alat KCKT dengan kondisi sesuai hasil optimasi.
Larutan sirup X dibuat sesuai prosedur pengujian sirup X pada uji akurasi. Larutan sirup X dibuat dengan memipet 1 ml LS, dimasukkan ke dalam sebuah
labu ukur 10 ml, diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH 4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda, disaring dengan penyaring syringe PTFE 0,4
5 µm, disonikasi selama 15 menit dan diinjeksikan 5
µl ke dalam alat KCKT dengan kondisi sesuai hasil optimasi.
Larutan baku dibuat dilakukan dengan memipet 1 ml LBC, dimasukkan ke dalam sebuah labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan campuran buffer fosfat pH
4,5 dan metanol 75 : 25 sampai batas tanda, disaring dengan penyaring syringe PTFE 0,4
5 µm, disonikasi selama 15 menit dan diinjeksikan 5 µl ke dalam alat KCKT dengan kondisi sesuai hasil optimasi.
Universitas Sumatera Utara
57
3.9.6 Penetapan Kadar Pemanis, Pengawet dan Pewarna dalam Sampel
