23 Jika massa molekul relatif 2000 dengan mempertimbangkan kelarutan
sampel dapat dilakukan sebagai berikut: a. Sampel tidak larut dalam air, maka dianjurkan untuk menggunakan
kromatografi partisi atau kromatografi padat cair. Jika analisis dilakukan rutin, disarankan menggunakan kromatografi partisi fase terikat normal karena
perawatan kolom tidak rumit. Untuk sampel isomer, lebih baik digunakan kromatografi padat cair. Sampel yang memiliki perbedaan ukuran partikel
digunakan kromatografi eksklusi sterik dengan fase gerak organik. b. Sampel larut dalam air, maka digunakan kromatografi partisi fase terbalik atau
kromatografi penukar ion. Kelarutan sampel dipengaruhi oleh keasaman pH, maka kromatografi penukar ion sebagai pilihan utama. Untuk kelarutan
sampel yang tidak dipengaruhi oleh pH dan bersifat non ionik, maka kromatografi partisi fase terbalik sebagai pilihan terbaik.
2.3.5 Fase Gerak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Pemilihan fase gerak hanya dapat dilakukan berdasarkan eksperimen trial and error hingga diperoleh kromatogram yang diharapkan. Fase gerak biasanya terdiri
atas campuran pelarut yang mempunyai daya elusi dan resolusi terhadap senyawa dalam sampel. Daya elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas pelarut, polaritas
fase diam dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal, yaitu fase diam lebih polar daripada fase gerak dan mempunyai kemampuan elusi meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik, fase diam kurang polar daripada fase gerak dan mempunyai kemampuan elusi menurun
dengan meningkatnya polaritas pelarut Dong, 2006; De Lux, 2004.
Universitas Sumatera Utara
24 Senyawa asam lemah atau basa lemah dipisahkan dengan menggunakan
fase gerak buffer untuk memperbaiki resolusi dan selektivitas. Pada larutan buffer asam, senyawa basa akan terionisasi sehingga lebih cepat terelusi, sedangkan
senyawa asam tidak terionisasi sehingga lebih lambat terelusi atau sebaliknya Dong, 2006.
Larutan buffer yang dipilih sebaiknya memiliki pH mendekati pKa senyawa sampel, kapasitas buffer yang cukup untuk menahan perubahan pH serta
range pH yang sesuai untuk senyawa sampel. Biasanya lebih baik buffer dengan pH + 1 unit dari pKa senyawa sampel, namun dapat juga digunakan buffer dengan
pH + 1,50 unit dari pKa senyawa sampel Dong, 2006. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik, yaitu komposisi fase gerak
tetap selama elusi atau dengan cara komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi yang biasa disebut dengan cara gradien. Elusi gradien digunakan untuk
meningkatkan resolusi campuran yang kompleks, terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas De Lux, 2004.
Fase gerak yang paling sering digunakan pada fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal digunakan campuran pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol
De Lux, 2004. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring untuk menghindari partikel-
partikel kecil. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di dalam
pompa dan detektor sehingga akan mengganggu analisis De Lux, 2004.
Universitas Sumatera Utara
25
2.3.6 Fase Diam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
