52 pewarna untuk isozim tertentu bersifat spesifik dan harus baru. Metode
pewarnaan mengikuti metode Wendel dan Weeden 1989, sedangkan bahan- bahan yang digunakan tercantum pada Lampiran 4. Sistem enzim yang dianalisis
adalah peroksidase PER, malat dehidrogenase MDH, alkohol dehidrogenase ADH, aspartat aminotransferase AAT, esterase EST, asam fosfatase ACP.
4.2.3.4. Analisis RAPD Isolasi DNA.
Isolasi DNA menggunakan metode CTAB Doyle dan Doyle 1987. Bahan yang dianalisis adalah daun ke 4 dari tanaman hasil perbanyakan
in vitro Gambar 18 diambil bagian pangkalnya sebanyak 0,5 g dan dipotong
A B
Gambar 18 Daun tanaman normal A dan daun tanaman variegata B untuk analisis RAPD dan isozim
kecil-kecil. Tanaman hasil SK 1 berumur 10 bulan setelah tanam di lapangan, SK 2 berumur 3 bulan dan SK 3 berumur 8 bulan. Masing- masing perlakuan terdiri
dari 4 tanaman. Potongan daun dimasukkan ke mortal, lalu ditambah PVPP dan nitrogen cair dan d igerus sampai halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam
tabung eppendorf yang telah berisi 600 µl larutan buffer ekstrak CTAB 2 wv CTAB, 1 M Tris-HCl pH 8, 0,5 M EDTA pH 8, 5 M NaCl dan 1 vv
mercaptoethanol, campuran dikocok kemudian dipanaskan dalam pemanas air
selama 30 menit pada suhu 65
o
C. Campuran dibiarkan hingga mencapai suhu kamar lalu ditambahkan 600 µl larutan kloroform : isoamilalkohol 24:1 dan
dikocok. Campuran disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Supernatan dipipet ke dalam tabung baru dan ditambahkan isopropanol dingin
dengan volume yang sama dan disimpan dalam freezer selama 60 menit atau
53 semalam. Camp uran dicairkan pada suhu kamar dan disentrifuse selama
15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Cairan dibuang dengan hati- hati dan pellet ditambah etanol 70 dingin sebanyak 100 µl dan disentrifuse selama
5 menit dengan 12 000 rpm. Cairan dibuang dan pellet dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Pellet yang telah kering ditambahkan 100 µl air bebas ion
dan dikocok hingga larut.
Pemurnian DNA. Pemurnian DNA menggunakan metode Sambrook
et al. 1989. Larutan DNA ditambah 1 µl RNAase dan dibiarkan pada suhu kamar selama 2 jam, lalu ditambahkan fenol kloroform isoamilalkohol dingin
sebanyak 100 µl dan disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Supernatan dipipet ke dalam tabung baru dan ditambahkan kloroform
isoamilalkohol dengan volume yang sama, selanjutnya disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm. Supernatan dipipet ke dalam tabung
baru kemudian ditambahkan natrium asetat 3 M pH 5,2 sebanyak 110 volume dan isopropanol dingin sebanyak 2,5 volume. Larutan dikocok hingga homogen
dan disimpan dalam freezer 60 menit atau semalam. Larutan disentrifuse selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm, pellet yang diperoleh ditambah etanol
70 sebanyak 100 µl dan disentrifuse selama 5 menit dengan 12 000 rpm. Cairan dibuang dan pellet dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Pellet yang
telah kering ditambahkan 100 µl air bebas ion dan dikocok hingga larut.
Uji kualitas DNA dengan gel agarose. Gel agarose 0,8 dibuat dengan
mencampur 0,32 g agarose dan 40 ml larutan TAE 1x, kemudian dipanaskan sampai mendidih. Larutan dibiarkan agak dingin dan dituang ke dalam cetakan
gel yang telah disiapkan posisi sisirnya. Gel dibiarkan memadat selama 1 jam. Hasil ekstraksi DNA sebanyak 5 µl dicampur dengan 1 µl Loading dye
dimasukkan ke dalam sumur gel. Elektroforesis dilakukan dengan alat elektroforesis pada 100 volt selama 30 menit. Gel yang telah selesai
dieletroforesis direndam dalam larutan ethidium bromida 0,1 dan dibilas dengan air selanjutnya pita DNA dilihat pada UV transiluminator.
Uji kuantitas dengan spektrofotometri.
Larutan DNA sebanyak 20 µl dimasukkan ke kuvet dan ditambahkan 1900 µl aquades steril. Larutan diukur
nilai absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kepadatan
54 optik OD 260 menunjukkan penyerapan sinar uv oleh nukleotida, sedangkan OD
280 menunjukkan penyerapan sinar uv oleh protein. Molekul DNA dikatakan murni jika rasio OD 260 terhadap 280 berkisar antara 1,8-2,0 Sulandari dan
Zein, 2003. Konsentrasi DNA untai ganda dihitung dengan menggunakan rumus:
[DNA] µgml = A260 x 50 x Faktor pengenceran
Amplifikasi RAPD dengan PCR . DNA yang dianalisis merupakan DNA
campuran dari 4 tanaman untuk masing- masing perlakuan. Primer yang digunakan adalah OPE 7, OPE 11, OPG 2 dan SBA 8. Campuran bahan PCR sebanyak 25 µl
terdiri dari 2 µl konsentrasi 25 ng, 16,77 µl air bebas ion, 2 µl MgCl
2
, 2,5 µl buffer bebas MgCl
2
, 0,6 µl dNTP, 0,13 µl Tag polimerase, 1 µl primer dimasukkan ke dalam tabung PCR dan ditambahkan 15 µl mineral oil. Campuran
divortek dan dimasukkan ke mesin PCR ASTEC Thermal Cycler PC 707 dengan program sebagai berikut: inisiasi denaturasi selama 1,5 menit pada suhu 94
o
C, amplifikasi 40 siklus masing- masing terdiri dari 0,5 menit pada 94
o
C, 1 menit 36
o
C, 2 menit pada 72
o
C, dan terakhir stop PCR selama 4 menit pada 72
o
C. Hasil amplifikasi dilihat dengan elektroforesis. Pelaksanaan elektroforesis hasil
PCR sama dengan proses pengujian kualitas DNA, namun konsentrasi gel agarosenya 1,2-1,5 dan perbandingan DNA hasil PCR: Loading dye adalah
10:2. Hasil elektoforesis divisualisasikan di atas uv transluminator dan didokumentasikan dengan kamera dan ditransfer ke disket.
4.2.4. Pengaruh BAP SK 2 terhadap Multiplikasi dan Kestabilan Genetik
