50 7
Panjang mahkota cm: diukur dari bagian pangkal mahkota sampai ujung daun mahkota
8 Panjang tangkai buah cm: diukur dari pangkal buah sampai daun bendera
9 Diameter tangkai buah cm: diukur pada bagian tengah dari tangkai buah
10 Diameter buah cm: diukur keliling buah selanjutnya dikonversi menjadi
diameter buah 11
Diameter hati cm: diukur pada bagian tengah hati dari buah yang telah dibelah horizontal
12 Tebal daging buah cm: diukur pada bagian tengah buah dari buah yang
telah dibelah horizontal 13
Kedalaman mata cm: diukur di tiga tempat dari buah yang telah dibelah horizontal
14 pH buah: buah diperas dan cairannya diukur dengan pH meter
15 Padatan Terlarut Total: cairan buah diteteskan pada refraktometer dan
dibaca nilainya Brix Tingkat kehomogenan data diuji dengan uji Barlet. Data yang diperoleh diuji
dengan uji F dan bila berpengaruh nyata pada taraf 5 dilakukan uji lanjut dengan duncan multiple range test DMRT.
4.2.3.3. Analisis Isozim
Langkah kerja dalam analisis isozim meliputi pembuatan larutan penyangga buffer, pembuatan gel, ekstraksi enzim, running dan pewarnaan.
Larutan penyangga ada 2 macam yaitu penyangga gel dan penyangga elektroda Tabel 9. Penyangga elektroda bisa dipakai maksimal 3 kali elektroforesis.
Pembuatan gel pati. Sebelum digunakan cetakan gel diolesi dengan
parafin cair untuk mempermudah melepas gel. Pati 10 dan larutan penyangga gel dimasukkan ke labuh didih, selanjutnya labu didih dimasukkan dalam
penangas air yang mendidih sambil terus diputar-putar sampai gel matang secara merata ±10 menit. Gel segera divakum selama 10 menit kemudian dituang
dalam cetakan dan dibiarkan sampai dingin pada suhu kamar untuk digunakan.
51 Tabel 9 Bahan-bahan kimia larutan penyangga dalam analisis isozim
Penyangga Bahan
Jumlah
Gel L-histidin pH 6
5 mM Elektroda
Asam sitrat monohidrat 50 mM
Tris pH 6 150 mM
Ekstraksi Tris-HCl buffer pH 7,5
7,5 mM sukrosa wv
5 PVP-40 wv
5 merkaptoetanol 0,1 vv
14 mM asam askorbat
50 mM dietilditiokarbamat
10 mM bovine serum albumin.
0,1
Ekstraksi enzim. Masing- masing perlakuan diambil 4 tanaman hasil
perbanyakan in vitro dan dieskstraksi secara terpisah. Pada saat analisis dilakukan dengan mencampur 4 ekstrak enzim dari masing- masing perlakuan.
Analisis isozim hanya pada populasi tanaman hasil SK 1. Bahan yang dianalisis adalah daun ke-4 dari tanaman nenas berumur 11 bulan setelah ditanam di
lapangan, bagian pangkal daun yang berwarna putih dipotong, dicuci dan dimasukkan ke dalam plastik. Sampel dibawa ke laboratorium dengan termos es
berisi es batu untuk menjaga kesegarannya. Daun sebanyak 0,8-1,0 g dipotong kecil-kecil dimasukkan ke dalam mortal yang dikelilingi es batu, kemudian
ditambahkan 1,2 ml buffer ekstrak moderat Tabel 9. Sampel digerus sampai halus dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml, selanjutnya disentrifuse
selama 10 menit pada suhu 5
o
C pada 12 000 rpm. Supernatan diambil dengan pipet mikro dan dimasukkan ke dalam tabung ependorf dan disimpan dalam
freezer.
Elektroforesis sampel.
Kertas saring dengan ukuran sesuai sumur dicelupkan ke ekstrak sampel dan diselipkan ke sumur gel dan sebagai kontrol
mobilitas elektroforesis digunakan bromfenol biru. Gel ditutup dengan plastik dan selanjunya dielektroforesis selama 5 jam dengan kuat arus konstan sebesar
18 mA.
Pewarnaan. Kertas saring yang ada di sumur dibuang dan gel diiris
secara horizontal menjadi 2 potongan untuk pewarnaan 2 macam enzim. Larutan
52 pewarna untuk isozim tertentu bersifat spesifik dan harus baru. Metode
pewarnaan mengikuti metode Wendel dan Weeden 1989, sedangkan bahan- bahan yang digunakan tercantum pada Lampiran 4. Sistem enzim yang dianalisis
adalah peroksidase PER, malat dehidrogenase MDH, alkohol dehidrogenase ADH, aspartat aminotransferase AAT, esterase EST, asam fosfatase ACP.
4.2.3.4. Analisis RAPD Isolasi DNA.
