Ekstraksi Protein HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

muda dapat dipanen 1-2 minggu setelah berbunga, buah tua 14-23 MST dengan ukuran buah 20-60 cm x 10-25 cm Rifai dan Reyes, 1994. Kemarongan berbunga sekitar 3BST, buah muda dipanen sekitar 3 MSA sedangkan buah tua 4-5 MSA. Buah berukuran 4-6 cm x 1.5-2.5 cm, berwarna hijau dengan garis putih ketika muda dan berubah kemerahan setelah masak. Menurut Boonkerd et al. 1994, umumnya ukuran buah kemarongan dapat mencapai 3-7 cm x 1-3.5 cm, buah muda berwarna hijau dengan garis putih setelah masak berubah merah. Paria ular mulai berbunga 5-6 MST, buah muda dipanen ± 8 MST atau setelah mencapai panjang 40-60 cm, buah tua 13-16 MST. Pada umumnya paria ular berbunga sekitar 5 MST, buah berukuran 30-180 cm x 2-10 cm. Buah muda dipanen sekitar 7 MST, buah tua 1- 2 bulan kemudian Gildemacher et al. 1994.

2. Ekstraksi Protein

Ekstraksi protein dilakukan pada tiga bagian tanaman yaitu akar, buah dan biji dari masing-masing spesies. Gambar 4 menyajikan bagian tanaman bligo, meliputi : a buah umur ± 9 MSA, b biji dari buah umur ± 9 MSA, dan c akar tanaman yang sudah dipanen. Sedangkan gambar 5 menyajikan bagian tanaman kemarongan, sebagai berikut : a buah muda umur ± 3 MSA, b buah tua umur ± 4 MSA, dan c akar dari tanaman yang telah berbuah. Pada gambar 6 tersaji tanaman paria ular, terdiri dari : a buah muda umur ± 3 MSA, b biji dari buah umur ± 7 MSA, dan c akar tanaman yang sudah dipanen. Hasil ekstraksi protein ditunjukkan dengan rendemen atau persentase dari protein yang diperoleh dibanding dengan berat tanaman yang diekstrak. Dari data Gambar 4. Bagian tanaman bligo, terdiri dari : A Buah, B Biji , dan C Akar. yang tersaji pada tabel 1 menunjukkan rendemen protein buah paling rendah pada ketiga spesies yang diteliti dibanding bagian tanaman lainnya, yaitu antara 0.04 - 0.05. Rendahnya rendemen protein ini karena kandungan air pada buah sangat tinggi, pada umumnya buah bligo mengandung air hingga 96 Rifai dan Reyes, 1994. Kandungan air pada buah kemarongan sekitar 94 Boonkerd et al. 1994, demikian pula pada buah paria ular mencapai 94 Gildemacher et al. 1994. Pada bligo rendemen protein akar 1.22 , lebih tinggi dibanding rendemen protein biji 0.35, untuk itu dari tanaman bligo direkomendasikan akar untuk aplikasinya. Rendemen protein dari buah muda kemarongan adalah 0.056, rendemen ini paling tinggi dibanding buah bligo maupun paria ular. Selanjutnya rendemen menurun seiring dengan pemasakan buah, rendemen protein pada buah tua sebesar 0.046. Penurunan rendemen kemungkinan tidak terjadi penimbunan protein pada biji dari buah tua karena tanaman ini satu-satunya spesies Cucurbitaceae yang dikembangbiakkan melalui stek Boonkerd et al. 1994. Rendemen protein tertinggi pada kemarongan 0.61 berasal dari akar, meskipun demikian akar tidak merupakan pilihan untuk aplikasi. Hal ini disebabkan struktur akar sebagian besar berkayu sehingga menyulitkan proses ekstraksi. Selain itu apabila akar A B C diambil tanaman mati, sedangkan untuk mendapatkan tanaman baru dibutuhkan waktu cukup lama. Pada biji paria ular rendemen protein mencapai 3.62 lebih tinggi dibanding protein dari akar dengan rendemen 1.62 karena sebelum diekstraksi biji dipisahkan dari kulitnya. Rendemen protein biji paria ular tersebut hampir sama dengan hasil penelitian Dong et al. 1994 pada isolasi â-kirilowin dari biji T. Kirilowii , ekstrak biji yang diendapkan dengan aseton menghasilkan rendemen 3.3. Dari biji dan akar paria ular diperoleh rendemen protein paling tinggi dibanding rendemen protein dari bagian tanaman dua spesies lainnya, sehingga kedua bagian tanaman ini dapat direkomendasikan untuk diaplikasikan. Dari beberapa penelitian dilaporkan bahwa dari akar dan biji Trichosanthes sp. ditemukan berbagai protein bioaktif. Akar Trichosanthes kirilowii Max, var. japonicum Kitam menghasilkan karasurin A Kitagawa et al. 1994 Trichosanthes anti HIV protein TAP 29 Dong et al. 1994. Gambar 5. Bagian tanaman kemarongan, terdiri dari: A Buah muda B Buah tua C Akar. A B C Gambar 6. Bagian tanaman paria ular, terdiri dari : A Buah, B Biji dan C Akar. Sedangkan dari biji Trichosanthes kirilowii dihasilkan B-kirilowin, protein penginaktif ribosom RIPs dan Trichokirin Dong et al., 1994. Menurut Janson dan Ryden 1998 masalah utama dalam esktraksi protein adalah dapat mengeluarkan protein dari sel tanpa terdegradasi atau terdenaturasi dan tidak terkontaminasi. Hal tersebut dapat diatasi antara lain dengan pemilihan medium ekstraksi yang tepat, waktu persiapan cepat dan pada kondisi temperatur rendah, serta kebersihan peralatan yang digunakan. Dikatakan pula bahwa Tabel. 1. Rendemen protein dari buah, biji dan akar dari 3 spesies Cucurbitaceae : bligo, kemarongan dan paria ular. Spesies Organ Rendemen B. hispida Thunb. Cogn bligo Buah Biji Akar 0.05 0.35 1.22 C. grandis L. Voigh kemarongan Buah muda Buah tua Akar 0.056 0.041 0.61 T. cucumerina L. var anguina L. Haines paria ular Buah Biji Akar 0.054 3.62 1.68 medium ekstraksi yang tepat adalah dapat menjaga kestabilan protein, dapat A A C C B B mengeluarkan protein secara efisien dari seljaringan, serta menghasilkan kesesuaian antara perolehan dan kemurnian maksimum. Ekstraksi protein dari buah pada 3 spesies yang diteliti menghasilkan rendemen relatif rendah antara 0.04 - 0.05, dibanding dengan rendemen protein dari buah paria yang mencapai 0.09-0.21 Kurniawati 2002. Diduga molaritas bufer yang digunakan untuk mengeluarkan protein dari sel dalam penelitian ini terlalu rendah yaitu 5 mM, sehingga tidak seluruh protein larut dalam bufer tersebut. Sedangkan pada ekstraksi protein dari buah paria digunakan bufer fosfat 50mM Kurniawati 2002, karena menurut Janson and Ryden 1998 kelarutan protein paling baik pada bufer dengan kekuatan ion sedang antara 0.05 – 0.1 M. Penggunaan bufer fosfat 5mM dalam penelitian ini mengikuti metode di- Toppi et al. 1996 yang melakukan ekstraksi protein yang berkhasiat antiproliferasi dari beberapa bagian tanaman yaitu daun muda, daun tua, akar, akar rambut dan kalus Luffa cylindrica. Pertimbangan lain digunakannya bufer fosfat 5 mM adalah untuk mendapatkan ekstrak protein yang lebih murni, sehingga pada uji aktivitas tidak berpengaruh negatif. Pada uji aktivitas protein buah paria terhadap proliferasi galur sel kanker in vitro, penggunaan bufer sodium fosfat 50 mM meningkatkan proliferasi 17.64 terhadap galur sel L-929, dan 5.64 terhadap galur sel KR4 Kurniawati, 2002. 3 Fraksinasi Protein Fraksinasi protein dengan khromatografi filtrasi gel dapat memisahkan protein berdasarkan ukuran molekulnya. Penggunaan Sephadex sebagai matriks berbentuk gel, terdiri dari granula yang membentuk struktur tiga dimensi atau jaringan polimer yang membentuk struktur jala cross-linked. Akibat struktur jala ini terbentuk pori pada granul, dimana ukuran pori ditentukan oleh derajat kerapatan jala, semakin besar derajat kerapatan jala pori semakin kecil. Sephadex-75 membentuk pori yang dapat dilewati protein dengan BM 3-80 kDa, dimana protein molekul besar akan terelusi lebih dulu diikuti protein dengan molekul lebih kecil Janson and Ryden, 1998. 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 frak si p ro te in a b s o r b a n s i 2 8 ak ar b u a h b iji Gambar 7. Pola pemisahan protein dari akar, buah dan biji bligo pada kromatografi filtrasi gel. Pola pemisahan protein dari akar, buah dan biji bligo tersaji pada gambar 7, dan rendemen masing-masing fraksi protein pada tabel 2. Fraksinasi protein buah terpisah menjadi 4 fraksi protein dengan total rendemen 0.03. Dari empat fraksi protein yang diperoleh, rendemen tertinggi dari BF3 0.02 dan fraksi protein lainnya BF1, BF2 dan BF4 rendemennya sangat kecil dibawah 0.01. Fraksinasi protein dari biji menghasilkan 4 fraksi protein dengan total rendemen 0.13, dan rendemen tertinggi 0.05 dari BS1, kemudian BS2 0.03, BS4 0.03. Sedangkan rendemen terendah dari BS3 yaitu 0.02 . Fraksinasi protein dari akar menghasilkan tiga fraksi protein dengan total rendemen 0.72, dan BR2 mempunyai rendemen tertinggi 0.54. Fraksi protein BR3 mempunyai rendemen sekitar 0.12, sedangkan BR1 mempunyai rendemen paling rendah yaitu sekitar 0.07. Dengan demikian hasil fraksinasi protein dari bagian tanaman bligo yang menghasilkan fraksi protein dengan rendemen paling tinggi berturut-turut adalah akar, kemudian biji dan buah. Pola pemisahan protein dari buah muda, buah tua dan akar kemarongan disajikan dalam gambar 8, dan rendemen masing-masing fraksi protein pada tabel 3. Pemisahan protein dari buah muda menghasilkan 3 fraksi protein dengan total rendemen 0.034, dan rendemen tertinggi adalah CYF3 0.02, diikuti CYF1 0.01. Sedangkan CYF2 mempunyai rendemen sangat rendah dibawah 0.01. Fraksinasi protein dari buah tua menghasilkan tiga fraksi protein dengan total rendemen sekitar 0.03. Rendemen tertinggi dari CMF3 lebih dari 0.01, selanjutnya diikuti CMF2 dengan rendemen 0.010 dan paling rendah CMF1 rendemennya dibawah 0.01. Fraksinasi protein dari akar menghasilkan 4 fraksi Tabel 2. Rendemen fraksi protein dari buah, biji dan akar bligo, hasil fraksinasi kromatografi filtrasi gel. Organ Tanaman No. Fraksi Fraksi Rendemen Buah BF1 BF2 BF3 BF4 14 3 71 12 0.004 0.001 0.021 0.004 Biji BS1 BS2 BS3 BS4 39 26 14 21 0.051 0.034 0.018 0.027 Akar BR1 BR2 BR3 9 75 16 0.065 0.540 0.115 protein dengan total rendemen 0.21, dan rendemen tertinggi dari CR2 yaitu 0.11. Selanjutnya CR1 0.06, kemudian CR3 0.03, sedangkan rendemen terendah 0.02 berasal dari CR4. Hasil fraksinasi protein dari bagian tanaman kemarongan menunjukkan bahwa bagian tanaman yang menghasilkan rendemen fraksi protein paling tinggi adalah akar, selanjutnya buah muda dan buah tua. Fraksinasi protein dari buah, akar, dan biji paria ular menghasilkan pola pemisahan yang disajikan pada gambar 9 dan rendemen protein masing-masing fraksi protein pada tabel 4. Fraksinasi protein dari buah, biji dan akar masing- masing menghasilkan tiga fraksi protein dengan total rendemen paling tinggi 1.18 dari fraksi protein biji, kemudian 0.81 dari fraksi protein akar dan paling rendah 0.03 dari fraksi protein buah. Fraksinasi protein dari buah meng- 0,5 1 1,5 2 2,5 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 fraksi p ro te in a b s o r b a n s i 280 n aka r b u ah m u d a b u ah tu a Gambar 8. Pola pemisahan protein dari akar, buah muda dan buah tua kemarongan pada khromatografi filtrasi gel. Tabel 3. Rendemen fraksi protein dari buah, biji dan akar kemarongan hasil fraksinasi kromatografi filtrasi gel. Organ Tanaman No. Fraksi Fraksi Rendemen Buah Muda CYF1 CYF2 CYF3 28 5 67 0.010 0.002 0.023 Buah Tua CMF1 CMF2 CMF3 19 36 45 0.005 0.010 0.012 Akar CR1 CR2 CR3 CR4 26 52 14 8 0.055 0.109 0.029 0.017 hasilkan fraksi protein TF2 dengan rendemen paling tinggi lebih dari 0.01. Kedua fraksi protein lainnya yaitu TF1 dan TF3 keduanya mempunyai rendemen sangat rendah kurang dari 0.01. Fraksinasi protein dari biji menghasilkan rendemen tertinggi 1.11 didapat dari TS3, diikuti oleh TS2 dengan rendemen 0.05, dan TS1 dengan rendemen 0.03. Fraksinasi protein dari akar juga menghasilkan tiga fraksi protein, dengan rendemen tertinggi 0.36 dari TR3, selanjutnya TR2 0.30, dan TR1 terendah 0.15. Pola pemisahan protein pada kolom kromatografi dipengaruhi antara lain oleh panjang dan diameter kolom, serta volume sampel yang dipisahkan. Untuk mendapatkan resolusi yang baik volume sampel disarankan tidak terlalu banyak, 0 ,5 1 1 ,5 2 2 ,5 3 1 4 7 1 0 1 3 1 6 1 9 2 2 2 5 2 8 3 1 fraksi p ro tein a b s o r b a n s i 2 8 0 n akar b u ah b iji Gambar 9. Pola pemisahan protein dari akar, buah dan biji paria ular pada kromatografi filtrasi gel. dan konsentrasi protein tidak terlalu tinggi. Volume sampel sebaiknya tidak lebih dari 3 – 5 dari total volume kolom, dan kandungan protein antara 10 -20 mgml. Wheelwright, 1991. Tetapi bila sampel hanya terdiri dari beberapa komponen saja dimungkinkan untuk memisahkan sampel dengan volume sekitar 10 dari total volume kolom. Pada penelitian ini volume protein yang dipisahkan sekitar 2.5–5 ml atau 5–10 dari total volume kolom, tetapi konsentrasi protein tidak diestimasi. Keberhasilan proses fraksinasi juga dapat dilihat dari hasil elektroforesis SDS-PAGE, terbentuknya pita lebih dari satu menandakan protein belum terpisah dengan sempurna. Dari hasil elektroforesis gambar 10-12 beberapa protein menunjukkan lebih dari satu pita, kemungkinan masih tercampur dengan protein lain yang berbeda BM. Pada pemurnian hyaluronidase dengan kromatografi filtrasi gel menunjukkan adanya dua pita dengan BM 106 dan 102 kDa Putranto, 2004. Terdapatnya pita ganda pada elektroforesis tidak selalu menunjukkan ketidakmurnian protein, tetapi protein tersebut memang merupakan gabungan dari dua rantai polipeptida. Misalnya pada Ebulin 1 kelompok RIPs tipe II, pada SDS- PAGE menghasilkan dua pita pada 26 dan 30 kDa Girbes, 1993. Pada penelitian ini pemisahan protein hanya dilakukan dengan kromatografi filtrasi gel. Untuk pemisahan protein idealnya diperlukan pemisahan bertingkat menggunakan beberapa kromatografi. Seperti pada isolasi â-kirilowin, pemisahan awal dengan kromatografi pertukaran ion menggunakan matriks CM-Sepharosa CL-6B, selanjutnya secara kromatografi filtrasi gel dengan matrik Sephadex Tabel 4. Rendemen fraksi protein hasil fraksinasi kromatografi filtrasi gel dari buah, biji dan akar paria ular. Organ tanaman No. Fraksi Fraksi Rendemen Buah TF1 TF2 TF3 23 49 28 0.006 0.014 0.008 Biji TS1 TS2 TS3 2 4 94 0.024 0.047 1.109 Akar TR1 TR2 TR3 19 37 44 0.154 0.300 0.356 G-100, kemudian dengan Fast Protein Liquid Chromatography FPLC dengan Kolom Mono-S Dong et al., 1994.

4. Uji Aktivitas Protein