tumbuh dan berkembang dengan stabil dalam medium tanpa ZPT, dan menghasilkan protein bioaktif dengan rendemen dan aktivitas tinggi, serta
mempunyai BM 20-40 kDa.
C. BAHAN DAN METODE 1. Tempat, Waktu, dan Bahan Penelitian
a. Tempat dan Waktu Penelitian
Pelaksanaan penelitian meliputi. induksi dan perbanyakan kultur akar rambut, isolasi, karakterisasi dan uji aktivitas protein dari akar rambut dilakukan
di Laboratorium Balai Bioteknologi BPPT, Puspiptek – Serpong. Penelitian dilakukan sejak bulan Juni 2002 dan selesai bulan Desember tahun 2003.
b. Bahan penelitian
Bahan tanaman awal eksplan adalah benih Trichosanthes cucumirena L. var anguina L. Haines, berasal dari tanaman koleksi di Kebun Percobaan IPB
Baranangsiang. Isolat baketri A. rhizogenes ATCC 15834 strain agropin dari koleksi Dr. Ir. Achkam Subroto, peneliti dari Pusat Bioteknologi LIPI.
2. Prosedur kerja
h. Induksi Kultur Akar Rambut
Eksplan benih Trichosanthes cucumirena L. var anguina L. Haines diambil dari buah tua umur 7 MSA. Benih dikupas kulit luarnya, direndam dalam
benlet dan agrimisin selama 2 jam, kemudian dicuci dengan akuades steril. Selanjutnya benih direndam larutan kloroks 20 selama 20 menit, dibilas akuades
steril 3 kali. Benih yang telah steril dikulturkan dalam media MS0 tanpa ZPT, kecambah umur 3 MST digunakan untuk percobaan.
A. rhizogenes dikulturkan dalam medium YMA, dengan komposisi 10g
manitol, 0.5g KH
2
PO
4
, 0.2g MgSO
4
7H
2
O, 0.1g NaCl, 0.4g esktrak yeast dan 12g agar bakto dalam 1 liter medium, diinkubasikan pada suhu kamar. Kultur umur
3 hari digunakan untuk menginfeksi tanaman percobaan. Batang tanaman dilukai dengan jarum preparat yang telah diolesi dengan
biakan A. rhizogenes, diinkubasikan dalam ruang kultur suhu 26
o
C, dan kelembaban 90, diamati kapan mulai muncul akar pada tempat infeksi. Akar
adventif yang tumbuh dari tempat infeksi dipindahkan ke medium MS0 padat
ditambah antibiotik cefotaxim 250 mgliter, disubkultur dua kali pada medium yang sama dengan interfal waktu 2 minggu. Subkultur kedua dalam medium
cefotaxim biasanya telah bebas dari Agrobacterium, subkultur berikutnya dapat dipindahkan ke medium tanpa antibiotik. Pada tahap ini diambil satu ujung akar
dari setiap kultur, dan dianggap sebagai satu klon. Pada subkultur berikutnya sebagian akar dipindahkan dalam medium MS0 cair, dikocok dengan shaker
kecepatan 100 rpm. Subkultur dilakukan setiap dua minggu, dengan memindahkan potongan ujung akar ke medium baru. Kultur yang telah stabil
diseleksi berdasarkan kecepatan pertumbuhannya, klon dengan pertumbuhan paling cepat dipilih untuk penelitian selanjutnya.
B. Kurva Pertumbuhan Akar Rambut Percobaan untuk mendapatkan kurva pertumbuhan akar rambut dilakukan
dengan perlakuan perbedaan berat inokulum. Perlakuan terdiri dari 0.15g, 0.20g, 0.25g dan 0.30g inokulum, masing-masing dikulturkan dalam 20 ml media MS0
cair dalam botol bervolume 250 ml, dikocok dengan kecepatan 100 rpm, dengan dua ulangan untuk setiap perlakuan.
Pengamatan dilakukan setiap dua hari sampai hari ke-21, sehingga untuk masing-masing perlakuan diperlukan paling sidikit 25 botol kultur. Pengamatan
dilakukan dengan memanen akar, kemudian dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas saring. Setelah itu ditimbang dan dihitung berat rata-
rata dari dua botol kultur untuk setiap perlakuan. Dari data berat biomasa pada setiap pengamatan dibuat kurva, dan dihitung perbandingan antara berat inokulum
dengan berat biomasa pada akhir pengamatan. c. Ekstraksi Protein
Ekstraksi Protein dilakukan mengikuti metode di Toppi et al. 1996 yang dimodifikasi BAB III C 2b.
d. Uji Aktivitas Protein
