ditambah antibiotik cefotaxim 250 mgliter, disubkultur dua kali pada medium yang sama dengan interfal waktu 2 minggu. Subkultur kedua dalam medium
cefotaxim biasanya telah bebas dari Agrobacterium, subkultur berikutnya dapat dipindahkan ke medium tanpa antibiotik. Pada tahap ini diambil satu ujung akar
dari setiap kultur, dan dianggap sebagai satu klon. Pada subkultur berikutnya sebagian akar dipindahkan dalam medium MS0 cair, dikocok dengan shaker
kecepatan 100 rpm. Subkultur dilakukan setiap dua minggu, dengan memindahkan potongan ujung akar ke medium baru. Kultur yang telah stabil
diseleksi berdasarkan kecepatan pertumbuhannya, klon dengan pertumbuhan paling cepat dipilih untuk penelitian selanjutnya.
B. Kurva Pertumbuhan Akar Rambut Percobaan untuk mendapatkan kurva pertumbuhan akar rambut dilakukan
dengan perlakuan perbedaan berat inokulum. Perlakuan terdiri dari 0.15g, 0.20g, 0.25g dan 0.30g inokulum, masing-masing dikulturkan dalam 20 ml media MS0
cair dalam botol bervolume 250 ml, dikocok dengan kecepatan 100 rpm, dengan dua ulangan untuk setiap perlakuan.
Pengamatan dilakukan setiap dua hari sampai hari ke-21, sehingga untuk masing-masing perlakuan diperlukan paling sidikit 25 botol kultur. Pengamatan
dilakukan dengan memanen akar, kemudian dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan kertas saring. Setelah itu ditimbang dan dihitung berat rata-
rata dari dua botol kultur untuk setiap perlakuan. Dari data berat biomasa pada setiap pengamatan dibuat kurva, dan dihitung perbandingan antara berat inokulum
dengan berat biomasa pada akhir pengamatan. c. Ekstraksi Protein
Ekstraksi Protein dilakukan mengikuti metode di Toppi et al. 1996 yang dimodifikasi BAB III C 2b.
d. Uji Aktivitas Protein
Uji aktivitas protein dilakukan dengan uji kematian larva udang mengikuti metode Meyer 1982 menggunakan larva A. salina Leach BAB III C. 2d.
e. Konfirmasi Transformasi
Klon akar rambut terpilih dilakukan analisis molekuler untuk memastikan
terintegrasinya T-DNA A. rhizogenes pada genom selnya, dengan teknik Polymerase chain reaction
PCR mengikuti methode Hamill et al. 1991. DNA A. rhizogenes
digunakan sebagai kontrol positif, DNA akar in vitro non- transformasi untuk kontrol negatif. Primer terdiri dari rolB1 5-ATG GATC-
CCAAATTGCTATTCCCCCACGA-3 dan rolB2 5-TAGGCTTCTTTCATTC- GGTTTACTGCAGC-3.
Isolasi DNA akar rambut dan akar non-transformasi mengikuti metode CTAB Doyle dan Doyle, 1991 yang dimodifikasi. Akar non-transformasi dan
akar rambut masing-masing 1g dibekukan dengan nitrogen cair, digerus dengan mortar dan pestel sampai menjadi serbuk. Kemudian dipindahkan ke tabung
konikal polipropilen ditambah 7 ml larutan bufer CTAB 100 mM Tris, 50mM EDTA, 1.4 mM NaCl, 1 CTAB, 2 SDS suhu 65
o
C, divortek dan diinkubasikan pada 65
o
C selama 2 jam. Setelah itu larutan didinginkan pada suhu kamar selama 5 menit, kemudian ditambah larutan 24:1=khloroform:
isoamilalkohol dengan volume sama, dikocok sampai terbentuk emulsi, disentrifus sehingga larutan terpisah menjadi dua fase. Larutan bagian atas
dipindahkan ke tabung lain, ditambah 2-propanol dingin dengan volume sama, diinkubasikan dalam es selama 30 menit, disentrifus agar DNA melekat pada
dasar tabung. Pelet DNA dibilas dengan 75 etanol dingin dan disentrifus, supernatan dibuang dan pelet DNA dikering anginkan dengan membalikkan
tabung. Selanjutnya pelet DNA ditambah larutan 1X TE 300-500 ml, ditempatkan dalam tabung ependorf dan disimpan pada suhu -20
o
C sampai DNA digunakan. Isolasi DNA bakteri dilakukan dengan mengkulturkan A. rhizogenes dalam
medium YMB, dikocok dengan shaker selama 2 hari. Selanjutnya disentrifus supaya bakteri mengendap, media dibuang dan pelet bakteri ditambah 1000 µl TE
1x diinkubasikan pada suhu ruang selama 15 menit. Kemudian ditambah 1 ml larutan NaOH 5M 40 µl + SDS 10 100 µl + dH2O 860 µl untuk melisiskan
dinding sel, diinkubasikan selama 10 menit. Setelah itu ditambah 1 ml larutan potasium asetat 5M 600 µl + asam asetat 115 µl + dH2O 285 µl, diinkubasikan
pada suhu ruang selama 10 menit, kemudian disentrifus. Supernatan dipindahkan ke tabung steril baru, ditambah 0,5 ml larutan fenol : kloroform : isoamil alkohol
= 25 : 24 : 1 untuk menghilangkan protein, dicampur sampai terbentuk suspensi dan disentrifus. Supernatan dipindahkan ketabung mikro steril baru, ditambah
etanol absolut dingin 2 x volume supernatan untuk mengendapkan DNA, diinkubasikan pada suhu -20
o
C selama 30 menit kemudian disentrifus. Supernatan dibuang, pelet DNA dicuci dengan 70 etanol, disentrifuse kembali kemudian
etanol dibuang dan pelet DNA dikering anginkan dengan membalikkan botol. Setelah kering dilarutkan dalam 200 µl TE 1x, disimpan pada -20
o
C sampai DNA digunakan.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan PCR, volume reaksi 25 µl yang mengandung bufer MgCl
2
3 µl, dNTP 2 µl, primer rolB1 1.25 µl, primer rolB2 1.25 µl, DNA Tag polymerase 0.25 µl, Genom 2µl, 10 x Bufer 2.5 µl dan dd H2O
12.75 µl. PCR dilakukan sebanyak 52 siklus yang dibagi dalam 4 tahap, tahap pertama satu siklus meliputi denaturasi pada 94
o
C selama 1 menit 30 detik, annealing
pada 45
o
C selama 1 menit dan ekstension pada 72
o
C selama 1 menit. Tahap kedua 30 siklus, sebagai berikut : denaturasi pada 94
o
C selama 45 detik, annealing
45
o
C selama 45 detik dan ekstension 72
o
C selama 45 detik. Tahap ketiga 20 siklus dimana denaturasi pada 94
o
C selama 45 detik, annealing pada 42
o
C selama 45 detik dan ekstension pada 72
o
C selama 45 detik. Tahap keempat ekstra ekstension pada 72
o
C selama 5 menit. Hasil amplifikasi dilihat dengan elektroforesis, 10 µl hasil PCR dicampur
dengan 2 µl loading bufer dilalukan dalam 1 gel agarose. Elektroforesis dioperasikan pada 800 A, 75 V selama 70 menit. Selanjutnya gel diwarnai dengan
etidium bromid selama 20 menit. Pita-pita DNA dilihat dengan menggunakan UV transiluminator.
f. Fraksinasi Protein Fraksinasi protein dilakukan secara kromatografi filtrasi gel menggunakan
matrik Sephadex G-75 Bab III C 2d.
g. Karakterisasi Protein Karakterisasi protein dilakukan secara elektroforesis SDS-PAGE Bab
IIIC 2f.
C. HASIL DAN PEMBAHASAN
