X = rata-rata jumlah sel pada 4 bidang pandang 2 = faktor pengenceran oleh penambahan 10 ì l biru trifan pada 10 ì l sel
10
4
= 1 ml perkapasitas hemasitometer Sel yang telah dihitung diencerkan dengan media tumbuh hingga mencapai
jumlah kurang lebih 4-5 x 10
4
ml. Suspensi sel diambil sebanyak 100 ì l dan dimasukkan kedalam sumuran lempeng mikrokultur 96 sumur secara aseptis,
diinkubasikan selama 24 jam untuk menstabilkan pertumbuhan kultur. Selanjutnya kultur ditambah ekstrak protein 20 ì l untuk setiap perlakuan dan
ditepatkan volumenya dengan 80 ì l media tumbuh hingga mencapai volume 200 ì lsumur.
Kultur yang telah diberi perlakuan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37
o
C, 5 CO
2
dan RH 90 selama 3-4 hari. Sebelum diamati kultur ditambah 10 µl MTT, diinkubasikan dalam inkubator 4-5 jam untuk kultur monolayer dan
24 jam untuk kultur suspensi. Selanjutnya ditambahkan 100 µl HCl dalam isopropanol dan disimpan dalam inkubator selama 1 jam, dibaca dengan
microtiter plate reader pada panjang gelombang 570 nm. Persentase proliferasi
adalah persentase dari perbandingan antara absorbansi perlakuan dengan absorbansi kontrol. Sedangkan Persentase penghambatan proliferasi adalah
persentase kontrol 100 dikurangi persentase proliferasi.
C. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini digunakan metode MTT untuk menghitung jumlah sel hidup. Metode MTT diketahui sebagai metode yang akurat, mudah dan
reproducible . Untuk menunjukkan keakuratannya pada gambar 21. ditunjukkan
hubungan antara absorbansi kultur dengan jumlah sel hidup dari galur sel HeLa dan galur sel K-562, dengan koefisien determinan masing-masing 0.9799 dan
0.9834. Penghitungan jumlah sel dengan MTT lebih akurat karena waktu
pembacaan serentak dan sel yang diukur hanya sel yang benar-benar hidup. Sel hidup mempunyai ensim suksinat dehidrogenase yang diproduksi dalam
mitokondria, ensim ini akan mereduksi garam tetrazolium membentuk kristal formazan berwarna biru yang dapat diamati dengan spektrofotometer. Kandungan
suksinat dehidrogenase didalam sel relatif konstan, sehingga konsentrasi formazan
yang dihasilkan dapat menggambarkan jumlah sel hidup dengan tepat Wilson, 1992.
Penghitungan sel pada kultur awal dilakukan dengan pewarnaan biru trifan, dihitung dengan hemasitometer dan mikroskop perbesaran 100x. Pada pewarnaan
biru trifan sel hidup terlihat jernih sedangkan sel mati berwarna biru. Sel mati kehilangan integritas membran sehingga dengan mudah biru trifan terserap
kedalam sel dan menghasilkan warna biru Wilson, 1992. Pada penelitian ini dilakukan pengamatan aktivitas protein terhadap
proliferasi sel. Menurut Freshney 1992 proliferasi dan deferensiasi sel dipengaruhi oleh faktor nutrisi seperti serum, ion Ca, dan hormon. Selain itu juga
kerapatan kultur serta interaksi antara matrik dan sel.
A. Galur Sel HeLa
y = 199,9x + 1018,9 R
2
= 0,9799 500
1000 1500
2000 2500
2 4
6
konsentrasi x 10
4
selml abs
or bans
i
B. Galur sel K-562
y = 226,1x + 1553 R
2
= 0,9834 1.000
2.000 3.000
2 4
6
konsentrasi x 10
4
selml abs
or bans
i
Gambar 21. Kurva standar galur sel kanker dengan metode MTT : A. Galur sel HeLa, B. Galur sel K-562
Hasil pengamatan aktivitas fraksi protein dari tanaman lapang terhadap proliferasi galur sel HeLa gambar 22, menunjukkan kecenderungan peningkatan
penghambatan proliferasi dengan meningkatnya konsentrasi sampel protein yang diberikan dari 10–50 µgml. Pada konsentrasi protein 50 µgml aktivitas
penghambatan proliferasi antara 28 – 37, dan diantara fraksi protein yang
diuji TS3 menunjukkan aktivitas penghambatan proliferasi paling tinggi pada semua tingkat konsentrasi.
Dengan persamaan regresi dari kurva aktivitas penghambatan proliferasi dan konsentrasi protein 10-50 µgml dapat dihitung IC
50
masing-masing fraksi protein gambar 28. IC
50
adalah konsentrasi protein yang dibutuhkan untuk menghambat proliferasi sel sebanyak 50 dibandingkan dengan kontrol. IC
50
dari CYF3, TR3 dan TS3 hampir sama, yaitu dicapai pada konsentrasi protein 84 – 86 µgml, sedangkan BR2 pada konsentrasi 105.59 µgml. Pada penelitian
Tumilisar 2001, pemberian fraksi protein asal biji blustru Luffa cylindrica L. Roem pada konsentrasi 1 µgml menyebabkan mortalitas sel HeLa 25-30. Kuo
dan Kuo 1997 menguji sitotoksisitas senyawa triterpen dari Celastrus hindsii terhadap galur sel HeLa, IC
50
diperoleh pada konsentrasi triterpen diatas 10 µgml.
Dari gambar 23 tersaji aktivitas penghambatan proliferasi protein dari akar rambut, menunjukkan bahwa aktivitas protein sebelum fraksinasi THR2 pada
semua tingkat konsentrasi protein 1-5µgml lebih rendah dibanding setelah frak-
5 10
15 20
25 30
35 40
10 20
30 40
50
konsentrasi protein υgml
P engh
am ba
tan P ro
lif e
ras i
A = BR2 B = CYF3
C = TR3 D = TS3
Gambar 22. Aktivitas penghambatan proliferasi fraksi protein dari tanaman lapang terhadap galur sel HeLa: A. Akar bligo BR2, B. Buah muda kemarongan
CYF3, C. Akar paria ular TR3, dan D. Biji paria ular TS3.
5 10
15 20
25 30
35 40
1 2
3 4
5
Konsentrasi protein ugml
P engha
m bat
an P ro
lif e
ra s
i
A=THR2 B=THR2-3
Gambar 23. Aktivitas penghambatan proliferasi protein dari akar rambut, terhadap galur sel HeLa : A. Klon THR2 B. Fraksi protein THR2-3.
sinasi THR2-3. Aktivitas penghambatan proliferasi dari protein akar rambut menunjukkan pola yang sama dengan fraksi protein dari tanaman lapang, me-
ningkatnya konsentrasi protein yang diberikan menaikkan aktivitas penghambatan proliferasi. Pada konsentrasi protein 5 µgml, protein sebelum fraksinasi THR2
menghambat proliferasi sel HeLa 26.39, sedangkan protein setelah fraksinasi THR2-3 dapat menghambat proliferasi 37.09. Aktivitas penghambatan
proliferasi dari THR2-3 pada konsentrasi 5µgml sama dengan aktivitas fraksi protein asal tanaman lapang TS3 37.60 pada konsentrasi protein 50 µgml.
IC
50
dari THR2 dapat dicapai pada konsentrasi protein 10.42 µgml, sedangkan dari THR2-3 pada konsentrasi 8.10 µgml. Penghambatan proliferasi dari protein
akar rambut sebelum maupun setelah fraksinasi cukup tinggi.
Gambar 24. Galur sel HeLa pada perbesaran 100x. A. Kontrol tanpa perlakuan B. Perlakuan,
A B
10 20
30 40
50 60
70
10 20
30 40
50
Konsentrasi Protein ugml
P engh
am ba
tan P ro
lif e
ras i
A=BR2 B=CYF3
C=TR3 D=TS3
Gambar 25. Aktivitas penghambatan proliferasi fraksi protein bioaktif dari tanaman lapang terhadap galur sel K-562 : A. Akar Bligo BR2, B. Buah muda
kemarongan CYF3, C, Akar Paria Ular TR3 dan D. Biji Paria ular TS3.
Penghambatan proliferasi asam brionolat asal akar rambut Trichosanthes kirilowii
var japonica terhadap galur sel HeLa, IC
50
diperoleh pada konsentrasi 51 µgml Kondo et al. 1995. Pada penelitian Tumilisar 2001 aktivitas protein
bioaktif dari akar rambut Luffa cylindrica pada konsentrasi 1 µgml mengakibatkan mortalitas sel HeLa 4 – 42 .
Pada gambar 25 disajikan aktivitas penghambatan proliferasi fraksi protein bioaktif asal tanaman lapang terhadap galur sel kanker K-562. Pada semua
perlakuan konsentrasi protein 10–50 µgml menunjukkan pola yang sama, dimana aktivitas penghambatan proliferasi paling rendah dari fraksi protein
CYF3, kemudian BR2, TR2 dan paling tinggi TS3. Dari persamaan regresi diperoleh IC
50
dari masing-masing fraksi protein gambar 28, dicapai pada konsentrasi protein 45 – 90 µgml. Aktivitas penghambatan proliferasi dari TS3
pada konsentrasi 50 µgml mencapai 57.81, sehingga IC
50
sudah dicapai pada konsentrasi 45 µgml. Sedangkan pada fraksi protein lainnya diatas konsentrasi
yang diujikan 67 – 90 µgml. Aktivitas penghambatan proliferasi fraksi protein akar rambut terhadap galur
sel K-562 baik dari klon THR2 maupun fraksinya THR2-3 gambar 26, cenderung meningkat dengan semakin bertambahnya konsentrasi protein yang
diberikan 1-5 µgml. Pemberian protein THR2-3 konsentrasi 5µgml mengha- silkan penghambatan proliferasi 61.15, dan IC
50
dicapai dibawah konsentrasi yang diujikan 3.91 µgml, sebaliknya IC
50
dari THR2 diatas konsentrasi yang diberikan 11.8 µgml.
10 20
30 40
50 60
70
1 2
3 4
5
Konsentrasi protein ugml
P engha
m bat
an P ro
lif e
ra s
i
A=THR2 B=THR2-3
Gambar 26. Aktivitas penghambatan proliferasi dari fraksi protein akar rambut terhadap galur sel K562 : A. THR2 B. THR2-3.
Berdasarkan IC
50
dari protein asal tanaman lapang menunjukkan bahwa fraksi protein BR2, TR3, TS3 lebih aktif menghambat proliferasi sel K-562
dibanding terhadap sel Hela. Sebaliknya fraksi protein CYF3 lebih aktif terhadap sel HeLa. Demikian pula dari protein asal akar rambut THR2 lebih aktif terhadap
HeLa, tetapi fraksinya THR2-3 lebih aktif menghambat proliferasi sel K-562. Menurut Wilson 1992 sitotoksisitas suatu senyawa terhadap galur sel
sangat tergantung pada sumber sel tumor yang dipergunakan baik spesies, organ maupun jaringan. Perbedaan sumber sel mempengaruhi sensitifitasnya terhadap
senyawa bioaktif. Sel HeLa berasal dari sel epitel sedangkan sel K-562 merupakan sel hematopoeitik, dimana kedua sel ersebut mempunyai reseptor
pada permukaan sel yang berlainan. Oleh karenanya kedua sel tersebut berbeda dalam merespon senyawa protein yang diberikan.
Gambar 27. Galur sel K-562 pada perbesaran 50x : A. Kontrol tanpa perlakuan
B. Perlakuan,.
A B
20 40
60 80
100 120
BR2 CYF3
TR3 TS3
THR2 THR2-3
fraksi protein IC
50
ug m
l
HeLa K-562
Gambar 28. IC
50
dari fraksi protein asal tanaman lapang dan akar rambut terhadap proliferasi galur sel HeLa dan K-562.
Tumilisar 2001 melaporkan pemberian protein asal biji blustru Luffa cylindrica
pada konsentrasi 1 µgml tidak menimbulkan mortalitas terhadap sel K-562. Sedangkan protein asal akar rambut dari tanaman yang sama pada
konsentrasi 1 µgml menyebabkan mortalitas hingga 25. Hasil penelitian Damayanthi 2002 yang menguji aktivitas oryzanol terhadap proliferasi sel
K-562, menunjukkan pada pemberian oryzanol konsentrasi 19 µgml dalam minyak bekatul tak tersabunkan dapat menghambat proliferasi sel sebesar 6 .
Kurniawati 2002 melaporkan hasil analisis statistik pengujian aktivitas protein asal beberapa species buah paria Momordica charantia terhadap
proliferasi galur sel kanker KR-4. Hasil analisis menunjukkan bahwa meningkatnya konsentrasi protein yang diujikan dari 100 – 400 µgml
meningkatkan secara nyata indeks penghambatan proliferasi sel. Pada pemberian ekstrak protein konsentrasi 400 µgml menghambat proliferasi galur sel kanker
KR-4 sebesar 21.96. Menurut Kuo dan Kuo 1997 antitumor triterpen dari Celastrus hindsii
dianggap aktif bila ED
50
dibawah 10 µgml. Triterpen maitenfolon A dapat menghambat proliferasi nasopharyx carcinoma KB dengan ED
50
3.8 µgml, dan hepatoma HEPA-2B dengan ED
50
2.3 µgml. Sedangkan Ahn et al. 1994 yang menguji sitotoksisitas limonoid dari Melia azedarach var Japonica terhadap
beberapa galur sel kanker menyatakan bahwa limonoid dikatakan aktif bila ED
50
• 4 µgml. Pada pengujian aktivitas flavonoid jeruk terhadap proliferasi beberapa
galur sel kanker, senyawa flavonoid dianggap tidak aktif bila mempunyai IC
50
diatas 40 µgml Kawai et al. 1999.
D. KESIMPULAN
