tanaman dan akar rambut beberapa spesies Cucurbitaceae terhadap proliferasi galur sel kanker HeLa dan K-562. Pengamatan dilakukan secara spektro-
fotometrik menggunakan metode MTT, absorbansi warna biru formazan diamati dengan ELISA plate reader pada panjang gelombang 570 nm.
B. BAHAN DAN METODE 1. Tempat, Waktu, dan Bahan Penelitian
a. Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, Kampus Dermaga - Bogor, dari
bulan Februari hingga Mei 2005. b. Bahan Penelitian
Sampel protein hasil dari percobaan 1 Bab II yaitu protein asal tanaman lapang, dan percobaan 2 BAB III protein dari akar rambut. yang semuanya
mempunyai aktivitas paling tinggi pada uji BSL. Protein asal tanaman lapang terdiri dari empat fraksi protein yaitu fraksi protein akar bligo BR2, buah muda
kemarongan CYF3, akar paria ular TR3 dan biji paria ular TS3. Sedangkan dari akar rambut, protein dari klon THR2 serta fraksinya THR2-3.
Galur sel kanker yang diuji terdiri dari dua jenis sel yaitu galur sel HeLa servic carcinoma manusia mewakili sel selapis dan dan K-562 erythroleukemia
manusia merupakan sel suspensi. Kedua galur sel diperoleh dari Laboratorium
kultur jaringan, Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Bahan lainnya adalah bahan
kimia untuk medium kultur DMEM dan bahan untuk pengamatan antara lain biru trifan, dan reagen MTT.
2. Persiapan Sampel Protein
Fraksi protein dari tanaman lapang masing-masing diberikan dalam 5 tingkat konsentrasi yaitu 10, 20, 30, 40 dan 50 µgml. Untuk mendapatkan
konsentrasi tersebut setiap fraksi protein ditimbang 2 mg dilarutkan dalam 1ml akuabides steril sehingga diperoleh konsentrasi protein 2000 µgml, kemudian
disterilkan dengan membran 0.22 µm. Selanjutnya dibuat stok dengan memipet setiap sampel 25 µl, 50µl, 75µl, 100µl dan 125 µl dan masing-masing dilarutkan
dalam 500µl medium tanpa serum.
Sampel protein akar rambut diberikan pada 5 tingkat konsentrasi lebih rendah yaitu 1, 2, 3, 4 dan 5 µgml. Untuk keperluan tersebut ditimbang 1 mg
protein dilarutkan dalam 1 ml akuabides atau setara dengan konsentrasi protein 1000 µgml, kemudian disterilkan dengan membran 0.22 µm. Untuk larutan stok
setiap sampel protein dipipet 5µl, 10µl, 20µl, 30µl dan 40µl, kemudian dilarutkan dalam 500µl medium tanpa serum. Pada setiap perlakuan digunakan 20µl sampel
200 µl sel dan medium.
3. Persiapan Media dan Kultur Sel Kanker
Media yang digunakan untuk melarutkan stok sampel maupun untuk pertumbuhan kultur adalah media DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium.
Bubuk media dilarutkan dalam 50 ml akuabides steril, sisa media dalam bungkus dibilas sampai semua media terlarut, kemudian distirer. Selanjutya ditambah
2.438 g Na HCO3 sambil terus distirer sampai larut, kemudian volume media ditepatkan sampai 1000 ml dan difiltrasi dengan filter membran 0.2 ì m. Medium
sebelum ditambah serum digunakan untuk melarutkan sampel protein yang akan diuji. Medium pertumbuhan ditambah dengan serum janin sapi Fetal Bovine
Serum 10, dan antibiotik Pen-Strep penicylline-streptomycine100 IU ml.
Pada umumnya penyimpanan sel jangka panjang dilakukan pada kondisi beku dalam nitrogen cair, sehingga untuk mengkulturkan kembali sel
diinkubasikan terlebih dulu pada suhu ruang sampai suspensi sel mencair. Sel yang telah mencair diambil setengahnya, kemudian dicuci dengan memindahkan
sel kedalam tabung sentrifuse steril dan ditambahkan media pencuci 5 ml, disentrifuse kecepatan 1000 – 1500 rpm selama 5-10 menit. Supernatan dibuang,
endapan sel ditambah media pencuci, disentrifuse kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama. Media pencuci dibuang, diganti dengan media tumbuh 5 ml
dan divortek hingga seluruh sel terlarut. Selanjutnya jumlah sel awal dihitung dengan hemasitometer dan mikroskop perbesaran 100 kali, dibantu dengan
pewarnaan biru trifan. Perbandingan volume suspensi sel dengan biru trifan adalah 1 : 1 10ì l suspensi sel ditambah dengan 10 ì l biru trifan. Sel mati
berwarna biru sedang sel hidup jernih. Rumus penentuan jumlah sel dalam setiap ml suspensi berdasarkan hasil
perhitungan dari 4 bidang pandang adalah sebagai berikut : Jumlah sel permililiter = X x 2 x 10
4
X = rata-rata jumlah sel pada 4 bidang pandang 2 = faktor pengenceran oleh penambahan 10 ì l biru trifan pada 10 ì l sel
10
4
= 1 ml perkapasitas hemasitometer Sel yang telah dihitung diencerkan dengan media tumbuh hingga mencapai
jumlah kurang lebih 4-5 x 10
4
ml. Suspensi sel diambil sebanyak 100 ì l dan dimasukkan kedalam sumuran lempeng mikrokultur 96 sumur secara aseptis,
diinkubasikan selama 24 jam untuk menstabilkan pertumbuhan kultur. Selanjutnya kultur ditambah ekstrak protein 20 ì l untuk setiap perlakuan dan
ditepatkan volumenya dengan 80 ì l media tumbuh hingga mencapai volume 200 ì lsumur.
Kultur yang telah diberi perlakuan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37
o
C, 5 CO
2
dan RH 90 selama 3-4 hari. Sebelum diamati kultur ditambah 10 µl MTT, diinkubasikan dalam inkubator 4-5 jam untuk kultur monolayer dan
24 jam untuk kultur suspensi. Selanjutnya ditambahkan 100 µl HCl dalam isopropanol dan disimpan dalam inkubator selama 1 jam, dibaca dengan
microtiter plate reader pada panjang gelombang 570 nm. Persentase proliferasi
adalah persentase dari perbandingan antara absorbansi perlakuan dengan absorbansi kontrol. Sedangkan Persentase penghambatan proliferasi adalah
persentase kontrol 100 dikurangi persentase proliferasi.
C. HASIL DAN PEMBAHASAN
