4. Fraksinasi Protein
Pada gambar 18 menyajikan pola pemisahan protein akar rambut klon THR2 dengan kromatografi filtrasi gel dan tabel 9 menyajikan total rendemen
masing-masing fraksi protein. Pemisahan protein akar rambut menghasilkan 4 fraksi protein dengan total rendemen 0.47. Rendemen tertinggi 0.29 dari
fraksi protein THR2-3, sedangkan THR2-4 dan THR2-2 keduanya menghasilkan rendemen yang sama 0.061, dan rendemen paling rendah dari THR2-1 hanya
0.056. Pola pemisahan protein dari akar rambut menghasilkan puncak yang saling
berhimpitan, diduga volume sampel yang dipisahkan terlalu banyak, atau konsentrasi protein pada sampel terlalu tinggi. Agar supaya pemisahan berhasil
dengan baik volume sampel tidak lebih dari 3 – 5 dari total volume kolom, dan kandungan protein sebaiknya antara 10 -20 mgml Wheelwright, 1991.
Meskipun pemisahan protein akar rambut kurang baik tetapi masih dapat dideteksi fraksi-fraksi protein dengan berat molekul tertentu.
Hasil proses fraksinasi tersebut dapat dilihat dari elektroforesis fraksi-fraksi protein dengan SDS-PAGE yang tersaji pada gambar 20, dimana diperoleh fraksi
protein dengan BM antara 16 – 29.5 kDa. Beberapa fraksi protein masih mempunyai lebih dari satu pita protein yang menandakan protein belum terpisah
dengan sempurna masih tercampur dengan protein lain yang berlainan berat molekulnya.
0 ,2 0 ,4
0 ,6 0 ,8
1 1 ,2
1 ,4
1 5
9 1 3 1 7 2 1 2 5 2 9 3 3 3 7 4 1 4 5 4 9 5 3 5 7 6 1
fra k s i p ro tein a
b s
o r
b a
n s
i 280 n
Gambar 18. Pola pemisahan protein dari akar rambut T. cucumerina L var anguina
L. Haines klon THR2 pada kromatografi filtrasi gel.
Tabel 9. Rendemen fraksi protein akar rambut T. Cucumerina L. var anguina L. Haines klon THR2 hasil fraksinasi kromatografi filtrasi gel.
Organ Fraksi
Fraksi Rendemen
Akar rambut T. Cucumerina
Klon THR2 THR2-1
THR2-2 THR2-3
THR2-4 12
13 62
13 0.056
0.061 0.29
0.061
5. Uji Aktivitas Protein
Dari uji aktivitas protein dengan uji kematian larva udang dapat diketahui konsentrasi ekstrak yang mematikan setengah dari hewan uji LC
50
dari masing- masing protein. Semakin kecil nilai LC
50
aktivitas protein semakin tinggi karena konsentrasi protein yang diperlukan untuk membunuh hewan coba semakin
sedikit. Pada tabel 10, nilai LC
50
dari protein setelah fraksinasi lebih kecil dibanding sebelum fraksinasi, menunjukkan meningkatnya kemurnian protein aktivitasnya
semakin tinggi. Sebelum fraksinasi aktivitas protein tertinggi dari klon THR8 LC
50
5.63 µgml, dan klon THR2 LC
50
5.76 µgml. Selanjutnya berturut-turut klon THR1, klon THR4 dan klon THR4, paling rendah dari klon THR3. Setelah
fraksinasi aktivitas protein meningkat, bahkan fraksi protein THR2-3 aktivitasnya sangat tinggi LC
50
0.92 µgml berbeda jauh dengan ketiga fraksi protein lainnya. Aktivitasnya fraksi protein lainnya yaitu THR2-4, THR2-2 dan THR2-1 antara
5-6 µgml. Tabel 10. Aktivitas Protein dan fraksinya dari akar rambut T. cucumirena L. var
anguina L. Haines pada uji kematian larva udang.
Species Klon
LC
50
ppm Fraksi
LC
50
ppm Akar rambut
T. cucumirena L. var
anguina L. Haines.
THR1 THR2
THR3 THR4
THR6 THR8
7.54 5.76
16.48 14.55
10.11 5.63
THR2-1 THR2-2
THR2-3 THR2-4
5.60 5.36
0.92 4.99
Dari hasil uji aktivitas protein juga terdapat keragaman aktivitas antara masing-masing klon, seperti keragaman hasil rendemen protein. Keragaman
aktivitas protein ini dapat juga sebagai akibat pengaruh transformasi atau akibat keragaman asal eksplan, karena eksplan berasal dari biji. Uji aktivitas protein
akar rambut sebelum fraksinasi lebih tinggi dibandingkan aktivitas protein buah, biji dan akar paria ular in vivo. Aktivitasnya meningkat pesat setelah fraksinasi,
berbeda jauh dari aktivitas fraksi protein biji TS3, fraksi protein buah TF2 dan fraksi protein akar TR3.
Hasil penelitian yang sama dijumpai pada uji aktivitas RIPs dari bagian tanaman dan akar rambut Luffa cylindrica L. Roem terhadap lisat reticulosit
kelinci. RIPs dari akar rambut mempunyai total aktivitas dan aktivitas spesifik paling tinggi dibanding dari biji, daun dan akar Luffa cylindrica L. Roem in vivo
di Toppi et al. 1996. 6. Uji Konfirmasi Transformasi
Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR pada klon THR2 disajikan pada gambar 19. Hasil analisis menunjukkan adanya pita DNA pada 780 bp yang
terdapat pada DNA A. rhizogenes lajur 2 dan pada DNA akar rambut THR2 lajur 3, tetapi tidak ditemukan pada DNA akar tanaman non-transgenik lajur 4.
Hal tersebut mengindikasikan terintegrasinya TL-DNA A. rhizogenes pada genom sel akar rambut THR2 yang ditandai dengan terdeteksinya gen rol B pada hasil
elektroforesis, dengan demikian klon THR2 adalah akar transgenik hasil transformasi A. rhizogen.
Menurut Nelsson dan Olsson 1997 gen rolB dengan Open Reading Frame ORF 777 bp ini sangat penting peranannya bahkan mutlak diperlukan pada
induksi akar rambut. Karena pada A rhizogenes yang mengalami mutasi pada gen rol
B menjadi tidak virulen. Peranan gen rolB pada pembentukan akar rambut adalah : 1 meningkatkan pool auksin aktif bebas dengan memediasi hidrolisis
IAA konjugat ester IAA glikosida yang tidak aktif, 2 meningkatkan sensitivitas sel terhadap IAA melalui peningkatan permiabilitas membran protein yang
mengikat auksin membran auxin binding protein, dan 3 mendorong pembentukan meristem.
.
Gambar 19. Hasil amplifikasi PCR dari DNA akar rambut T. Cucumerina L. var
anguina L. Haines klon THR2.
Hasil penelitian ini sama dengan hasil penelitian Subroto et al. 2001 pada amplikasi gen rolB dari akar rambut Solanum nigrum L yang diinfeksi
dengan A. rhizogenes ATCC 15834 strain Agropin, mendapatkan pita DNA pada 0.78kb. Damiano C. dan Monticelli S. 1998 juga mendapatkan pita DNA 0.78kb
pada amplifikasi gen rolB dari akar rambut beberapa tanaman buah yang
diinfeksi dengan A. rhizogenes strain 1855.
7. Karakterisasi protein Prinsip dasar dari SDS-PAGE adalah molekul yang bermuatan akan
bergerak dalam medan listrik dengan laju yang dipengaruhi oleh ukuran dan muatannya. Pada penelitian ini digunakan marker standar protein LMW yang
terdiri dari Lisosim 14 kDa, Tirosin 20 kDa, Karbonik anhidrase 30 kDa, Ovalbumin 45 KDa dan Albumin 66 kDa. Dari perhitungan berdasarkan jarak
tempuh sampel dan kurva standar marker protein dapat diketahui BM dari masing- masing fraksi protein.
Dari gambar 20 terlihat hasil elektroforesis dari empat fraksi protein akar rambut, THR2-1 mempunyai dua pita pada 17 dan 29.5 kDa, mendekati BM
protein penginaktivasi ribosom dari biji Paria M. charantia yaitu momordin a dan momordin-b dengan BM 29.4 kDa Minami et al. 1992. THR2-2 mempunyai
dua pita tipis pada 17 kDa dan pita lebih tebal pada 29 kDa. Sedangkan THR2-3 mempunyai dua pita tebal pada 16.5 dan 29 kDa, BM 29 kDa ini sama dengan
1. Marker DNA 2. DNA A. Rhizogenes
720 bp 3. DNA akar rambut THR2
720 bp 4. DNA Akar Non-
Transgenik
Gambar 20. Hasil elektroforesis SDS-PAGE dari fraksi protein akar rambut
T. cucumerina klon THR2
BM protein anti virus dari daun Phytolaca americana PAP Minami et al. 1992. THR2-4 mempunyai dua pita pada 16.5 dan 28 kDa, dimana salah satunya sama
dengan BM protein antivirus dari akar Bougainvillea spectabilis, BAP 1 dan protein antijamur protein PR-5 dari daun Cucurbita sp. keduanya mempunyai BM
28 kDa Cheong et al. 1997, Balasaraswati et al. 1998. BM dari fraksi protein akar rambut sama atau mendekati BM protein bioaktif dari tanaman lain, menurut
Stirpe et al. 1992 protein dengan kemiripan struktur yang sangat tinggi dan diduga mempunyai kesamaan fungsi dihasilkan oleh tanaman yang berbeda.
BM antara masing-masing fraksi protein sangat berdekatan, bahkan ada yang sama, menurut Stirpe et al. 1992 dari satu species atau dari satu bagian
tanaman dapat ditemukan lebih dari satu protein bioaktif yang mempunyai sekuen sangat mirip yang diduga sebagai isoform dari protein yang sama. Dalam analisis
genomik, protein yang hampir sama hanya berbeda beberapa asam amino saja disandikan oleh gen yang berbeda.
D. KESIMPULAN
Kategori