BIOSINTESIS PROTEIN PADA TANAMAN

semua gen rol mempunyai persamaan pola ekspresi yaitu pada jaringan tertentu tissue specific expression terutama meristem akar dan floem. Kecuali gen rolD ekspresinya diregulasi oleh perkembangan tanaman developmentally regulated expression , terjadi pada fase elongasiekspansi dan pemasakan jaringan. Promoter rolB terekspresi pada parenkhim floem dan sel ray, demikian pula promoter rol C diekspresikan pada sel floem Nilsson et al. 1997. Altamura et al. 1991 melaporkan ada korelasi tinggi antara ekspresi gen rol dan inisiasi akar, yang ditunjukkan dengan diekspresikannya promoter rolB dan rolC pada sel-sel pericycle sebelum dan selama inisiasi serta pertumbuhan akar adventif. Menurut Maurel et al. 1994, promoter rolB diaktivasi oleh auksin, sedangkan aktivitas rolC dimodulasi oleh sukrosa. Kandungan sukrosa paling tinggi terdapat didalam floem dimana sukrosa ditransportasikan. Sedangkan konsentrasi IAA maksimal terdapat didalam pembuluh kambium, tetapi sejumlah IAA juga ditransportasikan melalui floem. Pengaturan promoter rolB dan rolC oleh sukrosa dan auksin menunjukkan pentingnya peranan kedua senyawa tersebut selama inisiasi akar, keduanya merupakan komponen yang diperlukan dalam induksi akar adventif. Oleh karena itu sel-sel dengan kandungan sukrosa dan auksin tinggi kompeten sebagai asal meristem akar dan merupakan sel target yang ideal untuk infeksi A. rhizogenes, sel-sel tersebut adalah sel ray dan sel floem.

C. BIOSINTESIS PROTEIN PADA TANAMAN

Biosintesis protein pada tanaman bersifat khas berbeda dengan organisme lain, karena tanaman mampu mensintesis asam amino yang diperlukan untuk pembentukan protein Salysbury dan Ross, 1991. 1. Pembentukan Asam Amino Pembentukan asam amino pada tanaman memerlukan dua unsur penting yaitu karbon dan nitrogen, serta sulfur untuk asam amino tertentu. Berdasarkan cara mendapatkan sumber nitrogen Salysbury dan Ross 1991 membagi tanaman menjadi tiga kelompok: a melalui fiksasi N 2 , b menggunakan NO 3 sebagai sumber nitrogen, c menggunakan NH 4 sebagai sumber nitrogen. Pada proses fiksasi nitrogen terjadi reduksi N 2 oleh mikroorganisme prokariot membentuk NH 3 . Proses tersebut merupakan kerjasama secara simbiotik antara mikroorganisme dan sel akar, ditandai dengan terbentuknya nodul akar. Tanaman inang mensuplai karbohidrat hasil fotosintesis dari daun, ditrans- lokasikan melalui floem ke nodul akar dalam bentuk sukrosa. Kemudian sukrosa dioksidasi oleh bakteroid pada nodul akar, hasilnya untuk mereduksi NAD + menjadi NADH atau NADP + menjadi NADPH. Selain karbohidrat pada tanaman lain terjadi oksidasi piruvat yang mereduksi protein flavodoksin. Selanjutnya flavodoksin, NADH atau NADPH mereduksi feredoksin atau protein lain mirip feredoksin yang sangat efektif dalam mereduksi N 2 menjadi NH3. Reaksi fiksasi nitrogen yang mereduksi N2 menjadi NH3 sebagai berikut: N 2 + 16 ATP + 8e + 8 H ◊ 2NH 3 + H 2 + 16ADP + 16P i Tanaman yang menggunakan NO 3 sebagai sumber nitrogen mereduksi NO 3, sebagian besar terjadi di akar atau daun di tempat nitrat reduktase paling aktif. Proses reduksi nitrat terdiri dari 2 reaksi, masing-masing dikatalisir oleh ensim yang berlainan. Reaksi pertama reduksi nitrat ke nitrit dikatalisir ensim nitrat reduktase, terjadi di sitosol diluar organel sebagai berikut : NO3 - + NADPH + H + + 2e ◊ NO 2 - + NADP + H 2 O Selanjutnya nitrit dari sitoplasma ditransportasikan ke kloroplas daun atau ke proplastid akar. Reaksi berikutnya adalah reduksi NO2 - menjadi NH 4 + dikatalisir oleh ensim nitrit reduktase sebagai berikut : NO 2 - + 6Fd red + 8H + + 6e ◊ NH 4 + + 6 Fd ox + 2H 2 O Tanaman yang menggunakan NH 4 sebagai sumber nitrogen utama, mengabsorbsi nitrogen dalam bentuk NH 4 . Tanaman ini biasanya hidup didaerah dengan kondisi pH tanah rendah, sehingga menghambat proses nitrifikasi. Selain proses reduksi nitrogen pembentukan asam amino tertentu melibatkan asimilasi sulfur. Pada tanaman sumber sulfur umumnya dalam bentuk oksidasi atau sulfat, sehingga terjadi proses reduksi membentuk S = sebagai berikut : SO 4 = + ATP + 8e - +8 H + ◊ S = + 4H 2 O + AMP + PP i Sulfur merupakan unsur penting dalam pembentukan asam amino sistein dan metionin Crawford et al. 2000. Rangka karbon pada asam amino diperoleh dari berbagai asam organik produk berbagai proses reaksi antara lain siklus Calvin, glikolisis, dan siklus asam sitrat Coruzzi dan Last., 2000. Asam organik tersebut antara lain : a. á-ketoglutarat, menyumbangkan rangka karbon untuk asam amino glutamat, glutamin, histidin, prolin dan arginin. b. Oksaloasetat, menyumbangkan rangka karbon untuk asam amino aspartat, asparagin, treonin, isoleusin, metionin dan lisin. c. 3-fosfogliserat, sebagai sumber rangka karbon dari serin, glisin, sistein. d. Fosfoenol piruvat, merupakan sumber rangka karbon dari triptofan, tirosin dan fenilalanin. e. Piruvat , merupakan sumber rangka karbon dari alanin, leusin dan valin. Pembentukan asam amino melalui berbagai proses antara lain proses reduksi aminasi yang terjadi pada pembentukan glutamat dari á -ketoglutarat yang dikatalisir oleh ensim glutamat dehidrogenase. Selanjutnya pembentukan glutamin yang dikatalisir ensim glutamin sintetase, kemudian glutamin mentransfer gugus amidanya ke asam aspartat membentuk asparagin, dikatalisir ensim asparagin sintetase. Pembentukan asam amino lainnya melalui berbagai reaksi transaminasi dua arah. Reaksi transaminasi ini melibatkan perpindahan dua arah gugus α-amino dari suatu asam amino ke gugus α-keto dari asam α-keto, diikuti dengan terbentuknya asam amino baru dan asam α-keto baru Coruzzi dan Last, 2000. 2. Sintesis Protein Protein merupakan hasil ekspresi gen yang terbentuk melalui proses transkripsi, prosesing dan translasi. Pada proses transkripsi DNA dihasilkan pre-mRNA, selanjutnya pre-mRNA mengalami prosesing menjadi mRNA, kemudian mRNA ditranslasi atau diterjemahkan menjadi protein Sugiura dan Takeda, 2000.

a. Perangkat sintesis protein

Menurut Spremulli 2000 berbagai makromolekul yang berperanan dalam proses translasi, antara lain : - Messenger RNA mRNA Messenger RNA mRNA berperanan sebagai pola cetakan suatu rangkaian asam amino, dimana pola tersebut ditetapkan dalam rangkaian kodon pada mRNA. Kodon adalah rangkaian tiga basa yang berdampingan, yang berdasarkan sandi genetik mampu menyandi satu asam amino. - Transfer RNA tRNA Transfer RNA tRNA berperanan sebagai penterjemah runtunan kodon mRNA menjadi runtunan asam amino, dibantu seperangkat ensim. Antikodon tRNA mengenali kodon mRNA melalui pasangan basa, masing-masing basa dari kodon membentuk pasangan dengan basa yang komplementer dari antikodon. - Ribosom Merupakan organel tempat sintesis protein berlangsung, mempunyai struktur spesifik dan komplek. Pada sel eukariot ribosom terletak dalam sitoplasma, mempunyai koefisien sedimentasi 80S yang terbagi menjadi dua yaitu Subunit besar 60S dan Subunit kecil 40S. Subunit kecil terdiri dari molekul RNA tunggal 18S, sedangkan Subunit besar mempunyai tiga molekul RNA 28S, 7S, dan 5S. Pada ribosom terdapat satu situs untuk mRNA, dua situs untuk tRNA situs A dan situs P, dan satu situs untuk ensim peptidil transferase yaitu situs. Situs mRNA terdapat pada subunit kecil, sedangkan dua situs tRNA sebagian besar terletak pada subunit besar dan sebagian lagi pada subunit kecil, situs peptidil transferase pada subunit besar. Pada tanaman selain ribosom pada sitoplasma juga terdapat ribosom lain pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Ribosom organel berfungsi mensintesis protein yang diperlukan oleh organel tersebut .

b. Mekanisme sintesis protein

Mekanisme sintesis protein disebut translasi, karena merupakan penterjemahan dari pasangan empat macam basa asam nukleat kedalam 20 macam asam amino. Menurut Watson et al. 1998 mekanisme sintesis protein meliputi berbagai tahap sebagai berikut : - Pembentukan aminoasil-tRNA Pada proses ini terjadi perpautan antara asam amino dengan tRNA membentuk aminoasil-tRNA, dikatalisir aminoasil-tRNA sintetase, yang disebut activating enzyme. Perpautan ini berfungsi mengaktivasi gugus karboksil untuk membentuk suatu peptida. dan sebagai molekul adaptor karena asam amino tidak dapat mengenali langsung kodon pada mRNA. Satu aminoasil- tRNA sintetase mengkatalisir satu asam amino, karena setiap ensim berbeda ukuran, struktur subunit, maupun komposisi asam aminonya. Molekul tRNA penerima suatu asam amino mempunyai sekuensi basa spesifik untuk asam amino tersebut, sehingga dengan cepat dapat bergabung dengan sintetase yang sesuai. - Inisiasi Pada proses ini terjadi ikatan antara inisiator tRNA dengan tanda awal start signal dari mRNA. Inisiator tRNA menempati situs P peptidil pada ribosom. Proses inisiasi terdiri dari tiga tahap : - penempelan subunit kecil ribosom pada tRNA inisiator - penempelan mRNA pada kompleks subunit kecil ribosom dan tRNA inisiator - pembentukan kompleks subunit besar ribosom, subunit kecil ribosom, tRNA dan mRNA yang siap membaca kodon-kodon mRNA. Proses inisiasi dibantu dua molekul protein yang disebut eIF2 dan eIF3 eIF = eucaryotic initiation factor . Didalam sitoplasma kedua faktor inisiasi menempel pada subunit kecil ribosom. Fungsi eIF2 mendorong penempelan aminoasil-tRNA inisiator dan mRNA pada subunit kecil ribosom. Sedangkan eIF3 berfungsi memisahkan subunit kecil ribosom dari subunit besar setelah ribosom selesai melakukan translasi. - Elongasi Perpanjangan rantai polipeptida melibatkan sejumlah protein faktor perpanjangan EF elongation factor, enzim peptidil tranferase serta GTP. Proses ini terdiri dari tiga tahap, yaitu pengikatan aminoasil-tRNA pengenalan kodon, pembentukan ikatan peptida, dan translokasi. - Terminasi Merupakan akhir proses translasi yang terjadi bila tanda berhenti stop signal pada mRNA dibaca oleh protein faktor pembebas, dan terjadi pelepasan rantai polipeptida dari ribosom. Didalam setiap tahapan proses sintesis protein terjadi interaksi antara berbagai perangkat makromolekul yang berperanan dalam proses sintesis protein. Interaksi tersebut terjadi dalam semua tahapan sintesis protein yaitu didalam proses inisiasi, elongasi dan terminasi Spremulli, 2000. Proses inisiasi diawali dengan penempelan eIF2, GTP dan aminoasil-tRNA inisiator pada subunit kecil ribosom. Sedangkan eIF3 sudah lebih dulu menempel pada subunit kecil ribosom pada saat pemisahan kedua subunit ribosom setelah selesai proses translasi periode sebelumnya. Dengan adanya penempelan faktor inisiasi ini terjadi interaksi antara subunit kecil ribosom dengan mRNA, dimana subunit kecil ribosom akan menempel pada ujung 5 dan kemudian bergerak sepanjang mRNA untuk mencari kodon awal AUG. Pada proses inisiasi terjadi hidrolisis ATP menjadi ADP dan P yang diperlukan untuk mencari kodon awal. Setelah subunit kecil menyelesaikan inisiasi, subunit besar ribosom bergabung, dan GTP yang menempel pada eIF2 dihidrolisis menjadi GDP dan P. Kemudian. eIF2 dan eIF3 terlepas dari ribosom, dan ribosom siap memulai proses perpanjangan polipeptida. Pada akhir proses inisiasi subunit besar ribosom bersatu dengan subunit kecil ribosom dan berasosiasi dengan aminoasil-tRNA inisiator serta mRNA. Proses elongasi dimulai dengan masuknya aminoasil-tRNA kedua ke situs A. Pada prokariot masuknya aminoasil-tRNA dibantu oleh faktor elongasi EF-Tu serta GTP yang membentuk kompleks EF-Tu-GTP-aminoasil-tRNA. Setelah terjadi hidrolisis GTP menjadi GDP dan P, maka EF-Tu-GDP terlepas dari aminoasil-tRNA. Protein faktor elongasi lainnya EF-Ts mengembalikan EF-Tu- GDP menjadi EF-Tu-GTP untuk berperan kembali dalam siklus berikutnya. Sedangkan pada eukariot hanya ada satu protein faktor elongasi yaitu EF1 yang mempunyai peran kombinasi EF-Tu dan EF-Ts.Tahap berikutnya adalah pembentukan ikatan peptida. Bila antikodon pada aminoasil tRNA sesuai dengan kodon mRNA pada situs A, maka ensim peptidil transferase akan melepaskan asam amino dari tRNA pada situs P dan menggabungkannya dengan asam amino yang terdapat pada aminoasil-tRNA pada situs A. Pada aminoasil-tRNA asam amino berikatan dengan tRNA melalui gugus karboksilnya -COO- sedangkan gugus aminonya -NH dalam keadaan bebas. Peptidil tranferase akan melepaskan ikatan -COO- dari ujung 3 tRNA dari aminoasil -tRNA pada situs P dan merangkaikannya pada gugus amino pada situs A membentuk ikatan peptida, sehingga terbentuk dipeptidil pada situs A. Reaksi tersebut disebut reaksi transpeptidasi. Transpeptidasi berikutnya tidak akan berlangsung selama peptidil- tRNA masih berada pada situs A, maka untuk reaksi transpeptidasi berikutnya terjadi perpindahan tempat atau translokasi. Pada proses translokasi ini terjadi tiga pergerakan, yaitu : tRNA yang tidak bermuatan meninggalkan situs P, peptidil- tRNA berpindah dari situs A ke situs P, dan mRNA bergeser sejauh tiga nukleotida. Dengan demikian kodon berikutnya menduduki posisi yang dapat dibaca oleh aminoasil-tRNA baru. Translokasi memerlukan faktor elongasi kedua, yaitu EF2 translokase. GTP yang terikat oleh EF2 dihidrolisa pada saat translokasi. Hidrolisis GTP menyebabkan EF2 dikeluarkan dari ribosom, karenanya GTP juga berfungsi sebagai katalitik. Setelah translokasi, situs A menjadi kosong, dan segera mengikat aminoasil-tRNA baru untuk memulai elongasi berikutnya Terminasi terjadi bila ribosom menemukan salah satu kodon akhir UAA, UAG atau UGA. Pada kondisi tersebut tidak ada aminoasil-tRNA yang dapat menempel pada situs A, karena tidak ada tRNA dengan antikodon yang komplementer dengan tanda stop stop signal. Tetapi tanda stop ini dikenali oleh protein faktor pembebas RF = release factor. Kemudian RF berikatan dengan kodon akhir pada situs A, mengubah aktivitas peptidil transferase. Ensim tersebut tidak mereaksikan polipeptida dengan aminoasil-tRNA melainkan dengan H2O, akibatnya terjadi proses hidrolisis. Peptidil tRNA pada situs P dan rantai polipeptida terlepas dari tRNA, selanjutnya GTP terhidrolisis menjadi GDP dan P, disosiasi antara ribosom, tRNA dan mRNA, dan terurainya ribosom menjadi Subunit besar dan Subunit kecil.

D. PROTEIN BIOAKTIF