aktivitas. RIPs dari Luffa cylindrica yang diisolasi dari biji, daun muda, daun tua dan akar, mempunyai aktivitas berlainan di Toppi et al. 1996. Pada Phytolaca
americana , RIPs dari daun, biji dan akar berbeda jenis dan aktivitasnya Stirpe
et al. 1992.
Protein bioaktif selain mempunyai kemiripan struktur juga mempunyai BM yang berdekatan. Menurut Stirpe et al. 1992 RIPs mempunyai BM antara
26 - 32 kDa. Demikian pula beberapa protein bioaktif lainnya mempunyai BM pada kisaran tersebut, misalnya protein antivirus dari akar Bougainvillea
spectabilis , BAP 1 dan protein antijamur Protein PR-5 dari daun labu Cucurbita
sp . keduanya mempunyai BM 28 kDa Cheong et al. 1997, Balasaraswati et al.
1998. Protein anti virus dari daun Phytolaca americana PAP mempunyai BM 29 kDa. Protein penginaktivasi ribosom dari biji paria Momordica charantia
yaitu momordin a dan momordin-b mempunyai BM 29.4 kDa Minami et al. 1992.
Tujuan penelitian adalah melakukan penapisan bagian tanaman dari tiga spesies Cucurbitaceae yang menghasilkan protein dengan rendemen dan aktivitas
tinggi serta mudah di dalam penanganannya.
B. BAHAN DAN METODE 1. Tempat, Waktu, dan Bahan Penelitian
a. Tempat dan Waktu Koleksi tanaman induk sebagai sumber bahan ekstraksi protein ditanam dan
dipelihara di Kebun Percobaan Kampus IPB Baranang Siang. Kegiatan.isolasi, uji aktivitas dan karakterisasi protein dilakukan di Lab. Balai Bioteknologi BPPT,
Puspiptek - Serpong. Penelitian dilakukan pada bulan Juni 2001 sampai dengan Desember 2002.
B. Bahan Penelitian
Bahan tanaman terdiri dari tiga spesies Cucurbitaceae yaitu Benincasa hispida
Thunb. Cogn atau Bligo dan Coccinia grandis L. Voigh atau kemarongan, diperoleh dari koleksi Dr. Ir. Sandra Arifin Azis, MS. Sedangkan
Trichosanthes cucumirena L. var anguina L. Haines atau paria ular dari koleksi
Ir. Dewi Sukma, MSi. Ketiga spesies ditanam dan dipelihara di Kebun Percobaan
Institut Pertanian Bogor, Baranangsiang. Bahan untuk uji aktivitas : telur Artemia salina Leach
, dari Lab. Natural Product - SMEAO Biotrop Bogor. 2. Prosedur Kerja
a.
Persiapan Tanaman di Lapang
Tanaman yang dipersiapkan adalah tiga spesies Cucurbitaceae yaitu Benincasa hispida
Thunb. Cogn atau bligo, Coccinia grandis L. Voigh atau kemarongan, dan Trichosanthes cucumirena L. var anguina L. Haines atau paria
ular. Bligo dan paria ular diperbanyak melalui biji, sedangkan kemarongan melalui tunas. Biji dan tunas disemai dalam polibag kecil berisi medium tanah,
kompos dan pupuk kandang dengan perbandingan 1 : 1 : 1, dipelihara dalam rumah ketat serangga. Kecambah umur 2 minggu dipindah ke Kebun Percobaan,
ditempatkan dalam polibag besar dengan media yang sama, dan diberi para-para. Dari bligo digunakan 3 bagian tanaman, yaitu buah dan biji dari buah tua,
serta akar dari tanaman yang telah dipanen. Dari kemarongan digunakan akar dari tanaman yang telah berbuah, buah muda dan buah tua. Dari paria ular diambil
buah muda, biji dari buah tua, dan akar dari tanaman yang telah dipanen. b. Ekstraksi Protein
Ekstraksi protein dilakukan mengikuti metode di Toppi et al. 1996 yang dimodifikasi. Bahan tanaman diblender dengan PBS phosphate buffer saline,
terdiri dari 0,14 mM NaCl dalam 5 mM bufer fosfat pH 7. Ekstrak dimaserasi dengan bufer yang sama 1:5, diaduk stirer semalam dalam ruang dingin
± 4
o
C, kemudian disaring dengan pompa vakum, dan disentrifus 10.000 rpm selama 30 menit. Supernatan diendapkan dengan amonium sulfat kejenuhan 80,
diinkubasikan semalam, selanjutnya disentrifugasi 10.000 rpm selama 30 menit. Endapan dimasukkan dalam kantong cellophane, didialisis semalam dalam bufer
fosfat pH 7. Ekstrak protein pasca dialisis dikeringbekukan, untuk mengetahui besarnya rendemen.
Pada ekstraksi biji dilakukan ekstraksi lemak, dengan direndam petroleum eter dingin selama 3 jam pada suhu 4
o
C. Selanjutnya disaring dengan kertas saring, proses diulang dua kali dan dilanjutkan dengan ekstraksi protein seperti
tersebut diatas.
c. Fraksinasi Protein
Fraksinasi protein dilakukan dengan kromatografi filtrasi gel, menggunakan matrik Sephadex G75. Sephadex dilarutkan dalam akuades, dibiarkan semalam,
selanjutnya diisikan kedalam kolom dan disetimbangkan dengan bufer sodium fosfat pH 7. Protein dilarutkan dengan bufer, diisikan kedalam kolom, dan
dielusi dengan bufer yang sama. Fraksi yang keluar dari kolom ditampung dalam tabung yang tersusun dalam fraction collector, masing-masing tabung diberi tanda
dan diamati dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 280 nm. Selanjutnya dibuat kromatogram berdasarkan nomor tabung dan absorbansinya.
Dari kromatogram tersebut diketahui kelompok masing-masing fraksi. Fraksi sejenis disatukan, kemudian dikering-bekukan untuk mengetahui rendemennya.
d. Uji Aktivitas Protein Uji aktivitas protein dilakukan dengan uji kematian larva udang brine
shrimp lethality test , menggunakan larva Artemia salina Leach, mengikuti
metode Meyer 1982. Media tumbuh air laut dibuat dengan melarutkan 13.8g garam laut dalam 1 liter air dengan pH 8 – 8.5. Medium air laut buatan
ditempatkan dalam corong pemisah, kemudian telur artemia dimasukkan kedalamnya dan diberi penerangan serta aerasi. Pada hari berikutnya katup corong
dibuka supaya telur yang tidak menetas didasar corong terbuang. Larva ditampung dalam suatu wadah untuk memisahkan antara larva dengan cangkang telur yang
mengapung dibagian atas medium. Kemudian corong dibilas dengan medium, larva dikembalikan ditempat semula, dan hari berikutnya larva siap digunakan
untuk percobaan. Diharapkan larva untuk percobaan seragam, terdiri dari larva umur dua hari.
Larva ditempatkan dalam tabung percobaan, masing-masing tabung diisi dengan 3ml media kultur dan 20 ekor larva. Perlakuan terdiri dari 0, 10, 100 dan
1000 ì gml ekstrak protein, setiap perlakuan diulang 3 kali. Untuk mendapatkan konsentrasi tersebut masing-masing protein ditimbang 2 mg dilarutkan dalam 2 ml
media tumbuh. Selanjutnya dipipet berturut-turut 500 µl, 50 µl dan 5 µl untuk konsentrasi 1000 µgml, 100 µgml dan 10 µgml, ditambahkan media tumbuh
hingga mencapai volume 5 ml. Pada setiap perlakuan digunakan 20 ekor larva, dengan 3 kali ulangan.
Pengamatan dilakukan setelah 24 jam, dengan menghitung jumlah larva yang hidup. Berdasarkan jumlah larva yang memberikan respon mati, dapat
dihitung nilai LC
50
dengan komputer program Finney. e. Karakterisasi Protein
Karakterisasi protein dilakukan dengan SDS-PAGE menggunakan perangkat peralatan elektroforesis mini-gel. Gel terdiri dari 12 separating gel
dan 5 stacking gel. Pembuatan separating gel dilakukan dengan mencampur 2400 µl 30 akrilamid dan 0.8 bisakrilamid, 1500 µl 4X Tris-Cl pH 8.8, 60 µl
SDS 10 dan 1440 µl H
2
O dalam labu erlenmeyer. Kemudian ditambah 60 µl 10 amonium persulfat APS dan 6 µl tetrametil-ethilendiamin TEMED,
diaduk dengan cepat. Selanjutnya larutan dituang kedalam lapisan tengah plat gel elektroforesis GE sampai ketinggian 1.5 – 2 cm dari ujung permukaan lempeng
gelas. Penuangan dilakukan secepat mungkin agar larutan tidak mengalami polimerisasi dalam labu erlenmeyer.
Tahap berikutnya adalah pembuatan 5 stacking gel yang terdiri dari 666 µl 30 akrilamid – 0.8 bis-akrilamid, 750 µl Tris-Cl pH 6.8, 30 µl SDS 10 dan
1554 µl H
2
O dicampur dalam labu erlenmeyer. Kemudian ditambah dengan 50 µl 10 APS dan 5µl TEMED dicampur dengan cepat. Larutan tersebut dituang
kedalam plat GE diatas separating gel, kemudian diatasnya diletakkan sisir teflon. Setelah larutan terpolimerisasi, sisir teflon diangkat dari ujung gel sehingga
terbentuk sumuran. Piranti GE disusun sedemikian rupa, dimana plat GE terletak diantara
piranti GE bagian atas dan bawah. Piranti GE bagian atas dan bawah diisi dengan bufer eklektroforesis sehingga sumuran sampel pada stacking gel terisi bufer.
Persiapan sampel dilakukan dengan melarutkan 20 µl sampel protein dalam 5 µl stok bufer sampel, dipanaskan pada 100
o
C selama 1 menit. Selanjutnya sampel didinginkan kembali pada temperatur kamar, kemudian setiap sampel dipipet
10 µl diisikan kedalam sumuran. Elektroforesis dioperasikan pada 100 V, 100 mA selama 2.5 jam. Selanjut-
nya gel dilepaskan dari kedua lempengan gelas dan dipindahkan ke larutan staining Comassie brilliant blue R-250 selama 1 jam. Setelah itu gel dipindahkan
kedalam larutan destaining selama 30 menit, pembilasan dilakukan dua kali sehingga gel tampak bening dan terlihat pita-pita protein. Jarak tempuh
sampel pada permukaan gel diukur, dan dihitung BM sampel berdasarkan kurva standar dari marker standar protein LMW low molecular weight.
D. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
