Sukarelawan Penentuan Viskositas Sediaan Krim Pengujian Iritasi Terhadap Sukarelawan Pengujian Efektivitas Anti-aging Terhadap Sukarelawan

19

3.1.2 Bahan-bahan

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah serat mesokarp kelapa sawit. Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah n-heksan teknis PT. MAP, n-heksan p.a E-merck, kloroform p.a E-merck, metanol p.a E- merck, DPPH 1,1 diphenyl-2-picryl-hidrazyl, alkohol 95, indikator phenolphthalein PP 1, kalium hidroksida teknis dan kalium hidroksida 0,1 N, asam stearat, setil alkohol, sorbitol, propilen glikol, trietanolamin, metil paraben, air suling dan oleum citri.

3.2 Sukarelawan

Pemilihan sukarelawan dilakukan di Fakultas Farmasi USU berdasarkan kriteria inklusi antara lain wanita berusia sekitar 20 - 30 tahun, diperiksa dalam keadaan rileks menggunakan alat skin analyzer, memiliki tanda-tanda penuaan dini, tidak memiliki riwayat alergi pada kulit dan telah dikondisikan tidak menggunakan krim lain selama 4 minggu untuk terapi anti-aging. Sukarelawan bersedia mengikuti penelitian sampai selesai dan bersedia dilakukan uji iritasi dan uji efektivitas sediaan krim sebagai anti-aging selama penelitian berlangsung. Sukarelawan bersedia menandatangani surat pernyataan yang menyatakan ”setuju untuk ikut serta dalam penelitian”. Contoh surat pernyataan sukarelawan yang ikut serta dalam penelitian pada Lampiran 14 halaman 104.

3.3 Pembuatan Ekstrak

Serat mesokarp kelapa sawit diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut n-heksan. Ditimbang sebanyak 20 kg serat mesokarp sawit dimasukkan ke dalam sebuah wadah gelap, kemudian diekstraksi dengan pelarut n-heksan 20 sebanyak 80 L 1:4 sampai seluruh serat terendam, ditutup dan disimpan selama 2×24 jam terlindung dari cahaya dan kedap udara sambil sering diaduk, kemudian disaring hingga didapat maserat. Ampas serat dimaserasi kembali selama 2×24 jam sebanyak 2 kali menggunakan prosedur yang sama. Kemudian, seluruh hasil maserasi digabung, diserkai, dan dienap tuangkan. Dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu ±40°C hingga diperoleh ekstrak kental minyak. Ekstrak kental tersebut kemudian disentrifuge untuk mengendapkan asam lemak bebas dan filtratnya diambil sebagai sampel untuk melakukan formulasi sediaan krim. 3.4 Karakterisasi Serat dan Ekstrak Serat Mesokarp Kelapa Sawit 3.4.1 Penetapan kadar air serat mesokarp kelapa sawit Ditimbang serat di dalam cawan yang sudah dikeringkan sebanyak 10 g. Selanjutnya dikeringkan di dalam oven pada suhu 110°C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang setiap 30 menit pada periode pengeringan sampai diperoleh berat konstan. Rumus: Kadar air= W 1 − W2 W 1 × 100 Keterangan: W1 = Berat serat sebelum dikeringkan W2 = Berat serat setelah dikeringkan

3.4.2 Penetapan kadar air ekstrak serat mesokarp kelapa sawit

Sebanyak 10 gram ekstrak yang sudah dilelehkan tersebut ke dalam wadah kering. Keringkan di dalam oven pada suhu 130°±2°C selama 30 menit, kemudian segera masukkan ke dalam desikator, dinginkan selama 15 menit, lalu timbang. Ulangi pengeringan dalam oven selama 30 menit, pendinginan dalam desikator 21 dan penimbangan beberapa kali, sampai selisih berat antara 2 penimbangan berturut-turut tidak melebihi 0,02 dari berat sampel SNI 01-2901-2006. Rumus: Kadar air= W 1 − W2 W 1 × 100 Keterangan: W1 = Berat ekstrak sebelum dikeringkan W2 = Berat ekstrak setelah dikeringkan

3.4.3 Penetapan asam lemak bebas ekstrak serat mesokarp kelapa sawit

Ekstrak dalam keadaan cair sebelumnya dipanaskan tidak boleh lebih dari 10°C diatas titik leleh. Ditimbang sampel dalam botol sampel atau erlenmeyer 250 ml sebanyak 1 g. Selanjutnya ditambahkan alkohol yang telah dinetralisasi sebanyak 50 ml kemudian ditambahkan 1 - 2 tetes indikator phenolphthalein PP. Kemudian dititrasi dengan kalium hidroksida yang telah distandarisasi sampai terbentuk warna merah muda merah jambu yang stabil untuk minimal selama 30 detik SNI 01-2901-2006. Rumus: ALB= VT × N ×BM asam palmitat BS ×1000 × 100 Keterangan: N = Normalitas KOH BM asam palmitat = 256 gmol BS = Berat sampel VT = Volum titrasi

3.4.4 Penetapan bilangan DOBI Deterioration of Bleachability Index ekstrak

serat mesokarp kelapa sawit Ditimbang 0,1 g ekstrak dimasukkan ke dalam labu ukuran 10 ml. Kemudian ditambahkan n-heksan sampai garis tanda. Dibaca absorbansi di spektrofotometer UV- Vis pada λ = 269 nm dan λ = 446 nm. Rumus: DOBI = Absorbansi λ=446 nm Absorbansi λ=269 nm 22

3.4.5 Penetapan kadar karoten ekstrak serat mesokarp kelapa sawit

Dilelehkan ekstrak dibawah titik leleh. Kemudian ditimbang 0,0445 g sampel dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Lalu ditambahkan n-heksan sampai garis tanda LIB dihomogenkan dan diambil 100 µl dari LIB kemudian diencerkan di labu tentukur 10 ml dengan n-heksan sampai garis tanda. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang λ = 446 nm PORIM, 1998. Rumus: Total karotenoid ppm = B BMKaroten Abs V × × Keterangan: V = Volume pengenceran Abs = Absorbansi BM Karoten = 383 gmol B = Berat sampel yang ditimbang 3.5 Pengujian Aktivitas Antioksidan 3.5.1 Prinsip metode peredaman radikal bebas DPPH Pengukuran peredaman radikal DPPH 1,1 diphenyl-2-picryl-hidrazyl oleh suatu senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

3.5.2 Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Sebanyak 19,7 mg DPPH dilarutkan dalam metanol hingga volume 100 ml untuk mendapatkan larutan DPPH 0,5 mM konsentrasi 200 ppm. Dipipet sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda konsentrasi 40 ppm. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 400 - 800 nm Rohman, 2007. 23

3.5.3 Pembuatan larutan induk baku ekstrak LIB ekstrak

Sebanyak 25 mg ekstrak serat mesokarp kelapa sawit ditimbang, dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, dilarutkan dengan 3 ml kloroform lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda konsentrasi 1000 ppm.

3.5.4 Penentuan aktivitas antioksidan sampel uji

Larutan induk baku ekstrak dipipet sebanyak 0,13 ml; 0,52 ml; 1 ml; 2,1 ml; 2,6 ml; 3,13 ml dan 3,9 ml ke dalam labu tentukur 10 ml untuk mendapatkan konsentrasi larutan uji 0,5 ppm; 2 ppm; 4 ppm; 8 ppm; 10 ppm; 12 ppm dan 15 ppm, ditambahkan 2 ml kloroform, lalu dikocok. Setelah itu, ditambahkan 2 ml larutan DPPH 0,5 mM 40 ppm ke dalam masing-masing labu tentukur lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai garis tanda. Pengukuran dilakukan setelah didiamkan selama 60 menit menggunakan spektrofotometer UV-visible pada panjang gelombang 516 nm.

3.5.5 Penentuan nilai IC

50 Nilai IC 50 merupakan bilangan yang menunjukkan konsentrasi sampel uji µ gml yang memberikan peredaman DPPH sebesar 50 mampu menghambatmeredam proses oksidasi sebesar 50. Nilai 0 berarti tidak mempunyai aktivitas antioksidan, sedangkan nilai 100 berarti peredaman total dan pengujian perlu dilanjutkan dengan pengenceran larutan uji untuk melihat batas konsentrasi aktivitasnya. Hasil perhitungan dimasukkan ke dalam persamaan regresi dengan konsentrasi ekstrak ppm sebagai absis sumbu X dan nilai peredaman antioksidan sebagai ordinatnya sumbu Y. Nilai IC 50 konsentrasi sample uji yang mampu memerangkap radikal bebas sebesar 50 digunakan 24 sebagai parameter untuk menentkan aktivitas antioksidan sample uji Prakash, 2001. 3.6 Formulasi Sediaan Krim 3.6.1 Formula standar krim Young, 1972 R Asam stearat 12 g Setil alkohol 0,5 g Sorbitol 5 g Propilen glikol 3 g Trietanolamin 1 g Gliserin 1-5 tetes Metil paraben 1 sendok spatula Parfum 1-3 tetes Akuades ad 100

3.6.2 Formula modifikasi

Formula krim yang digunakan dimodifikasi tanpa gliserin, karena fungsinya sama dengan propilen glikol dan sorbitol sebagai humektan. R Asam stearat 12 Setil alkohol 0,5 Sorbitol 5 Propilen glikol 3 Trietanolamin 1 Nipagin q.s Parfum 1-3 tetes Air suling ad 100 Ekstrak serat mesokarp kelapa sawit yang digunakan dalam pembuatan sediaan krim anti-aging dengan variasi konsentrasi 0,5; 1; 2; 3 dan 5. Perhitungan dosis dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 90. Formulasi dasar krim tanpa ekstrak dibuat sebagai blanko. Rancangan formulasi dapat dilihat pada Tabel 3.1 di halaman 25 berikut ini. 25 Tabel 3.1 Komposisi bahan dalam krim Bahan Konsentrasi bb F1 F2 F3 F4 F5 F6 Basis Krim 100 99,5 99 98 97 95 Ekstrak serat mesokarp kelapa sawit - 0,5 1 2 3 5 Oleum citri tetes 3 3 3 3 3 3 Keterangan: F: Formula, F1: Dasar krim blanko, Krim ekstrak serat mesokarp kelapa sawit F2: 0,5, F3: 1, F4: 2, F5: 3, F6: 5

3.6.3 Pembuatan sediaan krim

Asam stearat, setil alkohol dimasukkan ke dalam cawan penguap dan dilebur di atas penangas air pada suhu 70°C massa I. Sorbitol, propilen glikol, Trietanolamin, metil paraben dilarutkan di dalam air panas bersuhu 70°C yang telah ditakar massa II. Direndam lumpang porselen dan alu dalam air panas yang suhunya 70°C selama 10 menit. Kemudian keringkan lumpang dan alu, masukkan massa I ke dalam lumpang, kemudian massa II digerus konstan sampai hampir terbentuk massa krim ditambah ekstrak serat mesokarp kelapa sawit dengan variasi konsentrasi pada masing-masing formula, kemudian gerus kembali dan ditambahkan 3 tetes oleum citri, dihomogenkan sampai terbentuk krim. Bagan pembuatan sediaan krim dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 65. 3.7 Pemeriksaan Terhadap Sediaan Krim 3.7.1 Homogenitas sediaan krim Sejumlah tertentu sediaan jika dioleskan pada sekeping kaca atau bahan transparan lain yang cocok, sediaan harus menunjukkan susunan yang homogen dan tidak terlihat adanya butiran kasar Ditjen POM, 1979. 26

3.7.2 Tipe emulsi sediaan krim

Penentuan tipe emulsi sediaan dilakukan dengan penambahan sedikit biru metil ke dalam sediaan, jika homogen dalam fase luar sewaktu diaduk, maka emulsi tersebut adalah tipe minyak dalam air ma, tetapi bila hanya bintik-bintik biru berarti sediaan tersebut tipe emulsi air dalam minyak am Ditjen POM, 1985.

3.7.3 Pengukuran pH sediaan krim

Pengukuran pH sediaan dilakukan dengan menggunakan pH meter. Alat terlebih dahulu dikalibrasi dengan menggunakan larutan dapar pH netral pH 7,01 dan larutan dapar pH asam pH 4,01 hingga alat menunjukkan harga pH tersebut. Kemudian elektroda dicuci dengan air suling, lalu dikeringkan dengan tissue. Sampel dibuat dalam konsentrasi 1 yaitu di timbang 1 gram sediaan dan diencerkan hingga 100 ml air suling. Kemudian elektroda dicelupkan dalam larutan tersebut. Dibiarkan alat menunjukkan harga pH sampai konstan. Angka yang ditunjukkan pH meter merupakan pH sediaan. Pengamatan dilakukan pada suhu kamar pada hari ke 0, 7, 14, 21, 28 dan 90 Rawlins, 2003.

3.7.4 Pengamatan stabilitas sediaan krim

Masing-masing formula krim dimasukkan ke dalam pot plastik, disimpan pada suhu kamar dan diukur parameter-parameter kestabilan seperti bau, warna dan pH di evaluasi selama penyimpanan 90 hari dengan interval pengamatan 0, 7, 14, 21, 28 dan 90 hari National Health Surveillance Agency, 2005.

3.8 Penentuan Viskositas Sediaan Krim

Penentuan viskositas sediaan menggunakan viskometer Brookfield. Caranya: sediaan dimasukkan kedalam gelas sampai mencapai volume 100 ml, 27 lalu spindel 64 diturunakan hingga spindel tercelup ke dalam formulasi. Selanjutnya alat dihidupkan dengan menekan tombol ON. Kecepata spindel diatur 12 rpm, kemudian dibaca skalanya dial reading dimana jarum merah yang bergerak telah stabil. Nilai viskositas ɳ dalam sentipoise cps diperoleh dari hasil perkalian skala baca dial reading dengan faktor koreksi f khusus untuk masing- masing kecepatan spindel. Pengamatan dilakukan pada suhu kamar pada hari ke 0, 7, 14, 21, 28 dan 90.

3.9 Pengujian Iritasi Terhadap Sukarelawan

Percobaan ini dilakukan terhadap 12 orang sukarelawan untuk mengetahui apakah sediaan yang dibuat dapat menyebabkan gatal, kemerahan dan pengkasaran pada kulit. Cara: Kosmetika dioleskan di belakang telinga atau di bagian lengan bawah, kemudian dibiarkan selama 24 jam dan lihat perubahan yang terjadi berupa gatal, kemerahan dan pengkasaran pada kulit Wasitaatmadja, 1997.

3.10 Pengujian Efektivitas Anti-aging Terhadap Sukarelawan

Pengujian efektivitas anti-aging dilakukan terhadap sukarelawan sebanyak 9 orang yang dipakai kulit mata kanan dan kiri bagian lateral menyamping dan dibagi menjadi 6 kelompok. Semua sukarelawan diukur terlebih dahulu kondisi awal kulit mata bagian lateral atau pada area uji yang telah ditandai dengan berbagai pameter uji, seperti: kadar air moisture, kehalusan evenness, besar pori pore, banyaknya noda spot, keriput wrinkle dan kedalaman keriput wrinkle’s depth dengan menggunakan alat skin analyzer dan moisture checker. Perawatan mulai dilakukan dengan membagikan sediaan krim sesuai konsentrasi 28 yang telah ditetapkan di atas untuk dipakai dirumah. Pemakaian krim mulai dilakukan dengan pengolesan hingga merata setiap dua kali sehari yaitu pada malam dan pagi hari setiap hari selama 4 minggu. Perubahan kondisi kulit diukur setiap minggu selama 4 minggu dengan menggunakan alat skin analyzer dan moisture checker, terdiri dari beberapa kelompok, yaitu: a. 3 sukarelawan pertama kelompok I : 3 kulit pada mata kanan bagian lateral untuk formula blanko krim tanpa ekstrak serat mesokarp kelapa sawit kelompok II : 3 kulit pada mata kiri bagian lateral untuk formula dengan krim ekstrak serat mesokarp kelapa sawit konsentrasi 0,5 b. 3 sukarelawan kedua kelompok III : 3 kulit mata kanan bagian lateral untuk formula dengan krim ekstrak serat mesokarp kelapa sawit konsentrasi 1 kelompok IV : 3 kulit mata kiri bagian lateral untuk formula dengan krim ekstrak serat mesokarp kelapa sawit konsentrasi 2 c. 3 sukarelawan ketiga kelompok V : 3 kulit mata kanan bagian lateral untuk formula dengan krim ekstrak serat mesokarp kelapa sawit konsentrasi 3 kelompok VI : 3 kulit mata kiri bagian lateral untuk formula dengan krim ekstrak serat mesokarp kelapa sawit konsentrasi 5.

3.11 Analisis Data