3.5.2 Pengujian Sampel dengan Metode TPC 3.5.2.1
Pengenceran
Dalam tahapan ini, bahan yang akan digunakan adalah sampel dan media yang telah dibuat sebelumnya, yaitu sampel yang telah diblender
dan ditimbang 20 gram, media NB 180mL dalam Erlenmeyer dan media NB sebanyak 9 mL dalam setiap tabung reaksi.Kemudian sampel
dimasukkan kedalam tabung erlenmeyer lalu di vortex. Ambil sebanyak 1 ml dari tabung erlenmeyer menggunakan tip 1000
μL, pindahkan ke tabung reaksi ke-1 lalu di vortex. Kemudian dilakukan pada tabung reaksi
berikutnya hingga pada tabung reaksi ke-6. Tabung reaksi ke-7 tidak dilakukan pengenceran dan dibiarkan berisi NB saja, untuk digunakan
sebagai kontrol negatif.
3.5.2.2 Penanaman Sampel dan Pembiakan Bakteri
Penelitian ini menggunakan uji metode sebar spread plate untuk kultur mikroorganisme dengan melakukan duplo dua kali pengulangan
pada konsentrasi 10
-4
sampai10
-7
, dan memakai kontrol negatif.
Pada media NA Nutrient Agar
Setelah tahap pengenceran, ambil sebanyak 0,1 ml menggunakan mikropipet dari tabung reaksi dan teteskan kedalam 2 cawan petri berisi
NA Nutrient Agar, beri label bertuliskan “3-1; 3-2” hingga “6-1; 6-2” dalam cawan petri tersebut. Pada kontrol negatif, teteskan 0,1 ml pada satu
cawan petri, beri label “kontrol”. Siapkan batang L dan rendam dalam
larutan alkohol. Setiap akan digunakan, batang L ini di dikeluarkan dari larutan alkohol, kemudian dilewati diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar
hingga sudah tidak panas. Goreskan batang L diatas media agar untuk meratakan larutan sampel.
Pada media spesifik Endo Agar dan SSA Salmonella Shigella Agar
Ambil 0,1 ml dari tabung dengan pengenceran
10-1
, teteskan kedalam cawan petri berisi SSA Salmonella Shigella Agar. Siapkan ose
bulat. Setiap sebelum dan sesudah dipakai, dipanaskan pada api sampai terlihat warna merah pada ose tersebut, diamkan hingga tidak panas.
Goreskan ose diatas media agar untuk meratakan larutan sampel, yang sebelumnya telah diteteskan kedalam cawan petri tersebut.
Gambar 3.2 Pengenceran dan Penanaman Sampel pada Media
3.5.2.3 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram
Bakteri yang telah tumbuh di media spesifik Salmonella Shigella Agar dan Endo Agar, dilakukan pewarnaan Gram. Mula-mula panaskan
ose diatas api, ambil NaCl atau aquades steril menggunakan ose, teteskan diatas kaca objek, yang telah diberi batas bentuk oval dibagian bawahnya.
Panaskan ose diatas api kembali, ambil koloni bakteri dalam media, oleskan pada kaca objek dan ratakan dengan NaCl atau akuades steril yang
telah diteteskan sebelumnya tidak melewati batas. Keringkan diatas api kecil atau diamkan hingga mengering dengan sendirinya. Teteskan Kristal
Karbol Ungu KKU atau Gentian Violet, diamkan selama 6 menit, bilas dengan air mengalir. Teteskan lugol, diamkan selama 45 detik-1 menit,
bilas dengan air mengalir. Teteskan alkohol 96, hingga tidak ada lagi larutan ungu yang luntur. Teteskan safranin, diamkan selama 2 menit, bilas
dengan air mengalir. Keringkan dengan menggunakan tisu, dengan tidak mengusap bagian atas gelas objek. Beri minyak immersi, lihat dibawah
mikroskop pembesaran 100x.
