31 Cara pembuatan: sebanyak 28 gram nutrient agar dilarutkan dalam air
suling steril ad 1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer lalu disterilkan di
autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Oxoid, 2013.
b. Nutrient Broth NB
Komposisi: Lab-Lamco powder
1,0 gram Yeast extract
2,0 gram Bacto peptone
5,0 gram Sodium chloride
5,0 gram
Cara pembuatan: sebanyak 13 gram nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril ad 1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan
panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disterilkan di autoklaf pada suhu 121
C selama 15 menit Oxoid, 2013. c.
Suspensi standard Mc. Farland Suspensi standard menunjukkan konsentrasi kekeruhan suspensi bakteri
sama dengan 10
8
CFUmL. Komposisi : Larutan asam sulfat 1
99,5 ml Larutan barium klorida 1,175 bv
0,5 ml Cara pembuatan: larutan asam sulfat 1 sebanyak 99,5 ml dan larutan
barium klorida 1,175 bv sebanyak 0,5 ml dicampurkan ke dalam tabung reaksi steril kemudian kedua larutan dikocok sampai homogen dan ditutup. Hasil
kekeruhan suspensi bakteri dihitung sama dengan kekeruhan suspensi standar, ini berarti hasil dari konsentrasi bakteri 10
8
CFUml Vandepitte, 1991.
32 d.
Media agar miring Cara pembuatan: 10 ml media agar yang telah dimasak dimasukkan ke
dalam tabung reaksi, ditutup dan dibungkus lalu disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
C kemudian tabung yang berisi agar diletakkan pada kemiringan 30 - 45
C. Perhatikan bahwa media agar tidak menyentuh tutup tabung. Media agar dibiarkan menjadi dingin dan keras Lay, 1994.
3.10 Pembuatan Stok Kultur Bakteri
Masing-masing sebanyak satu ose dari biakan murni bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 25922
digoreskan dengan metode cakram logam Punch Hole pada permukaan NA miring, ditutup mulut tabung reaksi dengan kapas, kemudian diinkubasikan
selama 18 - 24 jam pada suhu 37 C Depkes RI, 1995.
3.11 Pembuatan Inokulum Bakteri
Bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli hasil inkubasi diambil dengan jarum ose steril lalu disuspensikan kedalam tabung yang berisi 10 ml
larutan NB steril, kemudian dihomogenkan dengan vorteks hingga diperoleh kekeruhan suspensi bakteri yang sama dengan kekeruhan suspensi standar Mc.
Farland, ini berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
8
CFU Colony Forming Unitml. Pengenceran dilakukan dengan cara diambil 0,1 ml biakan bakteri 10
8
CFUml, dimasukkan kedalam tabung steril yang berisi larutan NB sebanyak 9,9 ml dan dikocok homogen maka diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi 10
6
CFUml Depkes RI, 1995.
33
3.12 Pewarnaan Gram
Objek glass dicuci dengan alkohol lalu difiksasi. Teteskan satu tetes aquadest pada objek glass lalu satu ose biakan koloni dihomogenkan atau
disuspensikan, ratakan dan keringkan dengan fiksasi, kemudian tambahkan satu tetes kristal violet biarkan selama 5 menit lalu bersihkan kristal violet yang tidak
terikat dengan bilasan air yang lembut, ditambahkan larutan lugol, ratakan lalu keringkan dengan cara difiksasi, cuci objek glass dengan alkohol 96 sampai
tetesan terakhir tidak berwarna dan dikeringkan, kemudian tetesi satu tetes safranin, biarkan selama 15 - 30 detik, cuci larutan safranin dengan aquadest
steril, keringkan dan lihat dibawah mikroskop Pratiwi, 2008.
3.13 Pembuatan Pengenceran Ekstrak
Sebanyak 5 gram ekstrak kental ditimbang seksama dengan neraca analitik, dilarutkan dalam 10 ml etanol 96 dan dimasukkan ke dalam labu takar
10 ml. Tambahkan etanol 96 hingga garis tanda dan diperoleh konsentrasi ekstrak adalah 500 mgml, selanjutnya larutan tersebut diencerkan kembali
dengan etanol 96 hingga diperoleh ekstrak dengan konsentrasi 400 mgml, 300 mgml, 200 mgml, 100 mgml, 90 mgml, 80 mgml, 70 mgml, 60 mgml, 50
mgml, 40 mgml, 30 mgml, 20 mgml, 10 mgml, 9 mgml, 8 mgml, 7 mgml, 6 mgml, 5 mgml, 4 mgml dan 3 mgml.
3.14 Uji Aktivitas Antibakteri
Masing-masing biakan koloni bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli dimasukkan 0,1 ml inokulum bakteri dengan konsentrasi 10
6
CFUml dimasukkan ke dalam cawan petri kemudian ditambahkan 15 ml media
