Lokasi Dan Waktu Penelitian Pembuatan Ekstrak

22 air, pipet tetes, vial, rotary evaporator Haake D dan tanur Ney M 525 Series II.

3.3.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquadest, aquadest steril, α-naftol, asam asetat anhidrida, asam klorida pekat, asam klorida 2 N, asam nitrat, asam sulfat pekat, asam sulfat 2 N, besi III klorida, bismuth III nitrat, benzen, biakan bakteri Staphylococcus aureus ATCC American Type Cultural Collection 25923, daun binara dan daun ulam-ulam, Escherichia coli ATCC 25922, etanol 70, isopropanol, iodium, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, Nutrient agar Difco, serbuk magnesium, serbuk zincum, timbal II asetat, suspensi Mc. Farland, toluena dan timbal II asetat,. 3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Bourchardat Sebanyak 4 gram kalium iodida ditimbang, dilarutkan dalam air suling secukupnya, kemudian sebanyak 2 gram iodium dilarutkan dalam larutan kalium iodida, setelah larut dicukupkan volume dengan air suling hingga 100 ml.

3.4.2 Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 8 gram bismuth III nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain sebanyak 27,2 gram kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan, didiamkan sampai memisah sempurna dan diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml. 23

3.4.3 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,3596 gram raksa II klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Wadah lain ditimbang sebanyak 5 gram kalium iodida lalu dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kedua campuran kemudian ditambahkan air suling hingga 100 ml.

3.4.4 Pereaksi besi III klorida 1 bv

Sebanyak 1 gram besi III klorida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air hingga 100 ml.

3.4.5 Pereaksi Molisch

Sebanyak 3 gram α-naftol ditimbang, kemudian dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100 ml.

3.4.6 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 gram timbal II asetat ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling bebas karbondioksida hingga 100 ml.

3.4.7 Pereaksi asam klorida 2 N

Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml.

3.4.8 Pereaksi natrium hidroksida 2 N

Sebanyak 8,002 gram pelet natrium hidroksida ditimbang, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml.

3.4.9 Pereaksi Lieberman-Burchard

Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrida dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat, lalu ditambahkan 50 ml etanol ke dalam campuran tersebut. 24

3.4.10 Pereaksi asam sulfat 2 N

Sebanyak 5,4 ml asam sulfat pekat diencerkan dalam air suling hingga 100 ml.

3.4.11 Pereaksi kloralhidrat

Sebanyak 50 gram kloralhidrat kemudian dilarutkan dalam 20 ml air suling. 3.5 Penyiapan Bahan Tumbuhan 3.5.1 Pengumpulan bahan tumbuhan Pengumpulan bahan dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan dari daerah yang lain. Bahan yang digunakan untuk penelitian adalah daun binara dan daun ulam-ulam, bagian daun yang diambil daun yang tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua yaitu daun keempat setelah dari pucuk daun dan daun kedua dari bawah. Daun binara dan daun ulam-ulam diambil dari ladang di daerah Kecamatan Simpang Empat Kabupaten Karo Provinsi Sumatera Utara.

3.5.2 Identifikasi tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Bogor Jl. Raya Jakarta-Bogor Km. 46 Cibinong, Indonesia.

3.5.3 Pengolahan tumbuhan

Bahan baku daun binara dan daun ulam-ulam yang masih segar, dikumpulkan, disortasi basah, dicuci bersih dibawah air mengalir, ditiriskan dan ditimbang berat basahnya. Daun binara dan daun ulam-ulam selanjutnya dikeringkan di lemari pengering hingga kering dengan temperatur 50 - 60 C, 25 kemudian disortasi kering dan ditimbang berat keringnya masing-masing, diblender dan ditimbang berat keringnya masing-masing, diblender hingga menjadi serbuk dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.

3.6 Pemeriksaan Karakterisasi Simplisia

Pemeriksaan karakterisasi simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air, penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu yang tidak larut asam Depkes RI, 1989.

3.6.1 Pemeriksaan akroskopik

Pemeriksaan makroskopik dilakukan terhadap daun binara dan daun ulam- ulam segar dan serbuk simplisia daun dengan cara memperhatikan bentuk, warna, bau dan rasa.

3.6.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap daun binara dan daun ulam- ulam segar serta serbuk simplisia dari kedua daun tersebut. Daun binara dan daun ulam-ulam segar dipotong tipis secara melintang di atas kaca preparat lalu diteteskan larutan kloralhidrat dan dipanaskan diatas api bunsen kemudian ditutup dengan kaca penutup dan diamati di bawah mikroskop. Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia dilakukan dengan cara menaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi dengan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian dilihat dibawah mikroskop.

3.6.3 Penetapan kadar air simplisia

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi Destilasi Toluen. Dalam labu alas bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, 26 kemudian didestilasi selama 2 jam, biarkan menjadi dingin selama 30 menit dan volume air dalam tabung penampung dibaca kemudian di dalam labu alas bulat dimasukkan 5 gram serbuk simplisia lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit, kemudian setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur yaitu 2 tetesan per detik sampai sebagian air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes per detik, setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penampung dibiarkan dingin sampai sama dengan suhu kamar sampai air dan toluena memisah sempurna kemudian dibaca volume air dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air di dalam bahan yang diperiksa WHO, 1992.

3.6.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 gram serbuk simplisia yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air dan kloroform 2,5 ml kloroform dalam air sampai 1000 ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam lalu saring, sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan berdasar rata dan telah ditara, sisanya dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1989. 3.6.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol Sebanyak 5 gram serbuk yang telah dikeringkan di udara dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan berdasar rata yang 27 telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1989.

3.6.6 Penetapan kadar abu total

Sebanyak 2 gram serbuk yang telah ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara. Krus dipijarkan pada suhu 600 C sampai arang habis kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara WHO, 1992.

3.6.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam

Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total ditambahkan 25 ml asam klorida 2 N dan didihkan selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, kemudian disaring melalui kertas saring bebas abu dan dicuci dengan air panas. Residu dan kertas saring dipijar pada suhu 600 C sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1989.

3.7 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia serbuk simplisia daun binara dan daun ulam-ulam meliputi pemeriksaan senyawa golongan kimia yaitu steroidatriterpenoida, alkaloida, glikosida, flavonoida, saponin dan tanin.

3.7.1 Pemeriksaan steroidatriterpenoida

1 gram sampel dimaserasi dengan 20 ml n-heksan ± 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap lalu tambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat, warna ungu merah menunjukkan 28 triterpenoida atau warna hijau biru menunjukkan steroida Farnsworth, 1966. 3.7.2 Pemeriksaan alkaloida Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 gram kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan sebagai berikut: a. 3 tetes filtrat ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer. b. 3 tetes filtrat ditambahkan 2 tetes pereaksi Bourchardat . c. 3 tetes filtrat ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff. Alkaloida positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga percobaan diatas Depkes RI, 1989.

3.7.3 Pemeriksaan glikosida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 gram, kemudian disari dengan 30 ml campuran 7 ml bagian etanol 96 dan 3 bagian volume air suling ditambah dengan 10 ml HCl 2 N, selanjutnya direfluks selama 30 menit, didinginkan dan disaring, ambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, lalu didiamkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2 isopropanol dilakukan berulang sebanyak tiga kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50 C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol, kemudian diambil 0,1 ml larutan percobaan dimasukkan kedalam tabung reaksi, diuapkan di penangas air, sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molisch, kemudian secara perlahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, jika terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan menunjukkan adanya glikosida Ditjen POM, 1995. 29

3.7.4 Pemeriksaan flavonoida

Sebanyak 10 gram serbuk simplisia ditambahkan 10 ml air, didihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, kedalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 gram serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1996.

3.7.5 Pemeriksaan saponin

Sebanyak 0,5 gram sampel dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik, timbul busa yang mantap tidak kurang dari 10 menit setinggi 1- 10 cm. Tambahkan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, bila buih tidak hilang menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1989.

3.7.6 Pemeriksaan tanin

Sebanyak 0,5 gram sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna, kemudian diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Farnsworth, 1996.

3.8 Pembuatan Ekstrak

Pembuatan ekstrak daun binara dan daun ulam-ulam dilakukan dengan cara perkolasi menggunakan pelarut etanol 70. Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 200 gram serbuk simplisia dimasukkan dalam bejana. Serbuk simplisia dimaserasi dengan penyari campuran etanol 70 sebanyak 500 ml, dibiarkan pada suhu kamar selama 3 jam, terlindung dari cahaya sambil sesekali diaduk kemudian dipindahkan massa tersebut sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, 30 tambahkan etanol 70 secukupnya hingga simplisia terendam dan terdapat cairan penyari di atasnya, perkolator ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam, selanjutnya kran perkolator dibuka dan dibiarkan cairan ekstrak menetes dengan kecepatan 20 tetes per menit dan ditambahkan etanol 70 berulang-ulang secukupnya dan diatur kecepatan penetesan cairan penyari sama dengan kecepatan tetesan perkolat, sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika cairan perkolat terakhir yang keluar tidak berwarna lagi Depkes, 1995.

3.9 Uji Aktivitas Antibakteri

3.9.1 Sterilisasi alat

Alat–alat disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai seperti alat-alat gelas disterilkan dengan menggunakan oven pada suhu 170 C selama 1 jam. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Jarum ose dan pinset dengan lampu bunsen Lay, 1994. 3.9.2 Pembuatan media Media yang digunakan terbagi dua yaitu: Nutrient Agar NA dan Nutrient Broth NB. Pembuatan media sebagai berikut: a. Nutrient Agar NA Komposisi: Lab-Lemco powder 1,0 gram Yeast extarct 2,0 gram Peptone 5,0 gram Sodium chloride 5,0 gram Agar 15,0 gram 31 Cara pembuatan: sebanyak 28 gram nutrient agar dilarutkan dalam air suling steril ad 1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Oxoid, 2013. b. Nutrient Broth NB Komposisi: Lab-Lamco powder 1,0 gram Yeast extract 2,0 gram Bacto peptone 5,0 gram Sodium chloride 5,0 gram Cara pembuatan: sebanyak 13 gram nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril ad 1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disterilkan di autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Oxoid, 2013. c. Suspensi standard Mc. Farland Suspensi standard menunjukkan konsentrasi kekeruhan suspensi bakteri sama dengan 10 8 CFUmL. Komposisi : Larutan asam sulfat 1 99,5 ml Larutan barium klorida 1,175 bv 0,5 ml Cara pembuatan: larutan asam sulfat 1 sebanyak 99,5 ml dan larutan barium klorida 1,175 bv sebanyak 0,5 ml dicampurkan ke dalam tabung reaksi steril kemudian kedua larutan dikocok sampai homogen dan ditutup. Hasil kekeruhan suspensi bakteri dihitung sama dengan kekeruhan suspensi standar, ini berarti hasil dari konsentrasi bakteri 10 8 CFUml Vandepitte, 1991.