6. Preparasi sel SiHa
a. Propagasi sel SiHa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, segera dicairkan dalam penangas air
37
o
C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640.
Suspensi sel disentrifus 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI 1640 yang baru, disuspensikan perlahan-lahan. Suspensi
sel disentrifus kembali 2010 xG selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang
mengandung 10 FBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator
pada suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut.
b. Panen sel SiHa Setelah jumlah sel cukup, medium diganti dengan medium RPMI 1640 baru
sebanyak 5 ml dan sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan
ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifus 2010 xG selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan
dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung jumlahnya menggunakan haemocytometer. Pada suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga
memperoleh konsentrasi sel sebesar 3.10
4
100 μl dan siap dipakai untuk penelitian
lebih lanjut Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7. Preparasi sel Vero
a. Propagasi sel Vero Sel diambil dari nitogen cair, segera dicairkan dalam penangas air 37º C,
kemudian ampul disemprot dengan etanol cair 70. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung steril yang berisi medium M199. Suspensi sel
disentrifus 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti M199 baru, disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifus lagi 2010 xG selama 5 menit,
supernatan dibuang. Sel ditambah 1ml medium pertumbuhan yang mengandung 10 FBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel ditumbuhkan
dalam beberapa buah tabung biakan kecil 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan dengan konfluen dan jumlahnya cukup untuk
penelitian lebih lanjut. b. Panen sel Vero
Setelah jumlah sel cukup siap panen, sel dicuci dengan FBS 10 satu kali sebanyak 3 ml. Kemudian diberi tripsin 0,25 sebanyak 1 ml untuk melepaskan
sel-sel. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan FBS 10 sebanyak 3 ml.
Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifus selama 3 menit. Untuk menghilangkan sisa tripsin, sel dicuci sekali lagi dengan
menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah sel dengan
menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
memperoleh konsentrasi sel sebesar 3 x 10
4
100 μl dan siap dipakai untuk
penelitian Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989.
8. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki
a. Sel SiHa
Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 μl suspensi sel SiHa dengan kepadatan
3x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi
100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 4000 µgml pada sumuran B
2
, B
3
dan B
B
4
pada baris 2, kemudian pada sumuran C
2
, C
3
dan C
4
di baris 2 ditambahkan 100
μl suspensi sel SiHa pada sumuran yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 2000 µgml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri
kadar terendah yang digunakan dalam penelitian. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi 100 µl medium RPMI 1640.
Untuk faktor koreksi, 100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi 100 µl medium RPMI 1640. Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24
jam suhu 37 C, dalam inkubator dengan aliran 5 CO
o 2
. Pada akhir inkubasi, ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 10
μl MTT 2,5
μgml dalam media RPMI 1640, lalu diinkubasikan semalam pada suhu 37
o
C, dalam inkubator dengan aliran CO
2
5. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100
μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan ELISA reader pada panjang gelombang
550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Sel Vero
Untuk uji sitotoksisitas fraksi protein umbi teki pada sel Vero menggunakan langkah yang sama dengan uji sitotoksisitas pada sel SiHa. Perbedaannya hanya
terletak pada media yang digunakan, yakni M199 Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al., 1989.
9. Perhitungan persen kematian sel dengan metode MTT
Hasil dari metode MTT berupa absorbansi, didapat dari ELISA Reader mencerminkan jumlah sel yang hidup. Persen kematian sel dapat dihitung dengan
rumus : Kematian =
100 x
A C
B A
− −
Meyer et al., 1982 cit., Candra, 2006 Keterangan :
A = Rata-rata absorbansi kontrol B = Rata-rata absorbansi perlakuan
C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel
Metode perhitungan statistik menggunakan analisis probit yang dilakukan untuk mengetahui harga LC
50
, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan uji t- independent untuk melihat perbedaan nilai LC
50
antara sel SiHa dan sel Vero. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori