Perhitungan persen kematian sel dengan metode MTT

C. Preparasi Sampel Fraksi Protein Umbi Teki

Bahan umbi teki yang akan diteliti dicuci bersih untuk menghilangkan tanah dan bahan asing lain yang melekat. Umbi dirajang dan disimpan dalam freezer sampai dilakukan preparasi sampel. Hal ini dimaksudkan untuk mempermudah dalam penumbukan bahan. Semua perlakuan protein dilakukan secara steril pada suhu dingin 4 C untuk mencegah denaturasi dan reaksi enzim proteolisis yang dapat merusak protein. Fraksi protein ekstrak gubal diperoleh dengan penambahan sejumlah larutan dapar natrium fosfat 5 mM yang mengandung NaCl pada umbi teki yang telah ditumbuk halus. Larutan dapar berfungsi untuk memudahkan protein terekstraksi dari selnya yang terdapat pada umbi, dengan pH 7,2 ditujukan untuk menciptakan kondisi isotonis dengan cairan di dalam sel tumbuhan. Dengan adanya NaCl, protein akan berada dalam keadaan terlarut dan stabil di dalam dapar. Bahan diperas dan cairan yang diperoleh disentrifus selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh sebanyak 700ml merupakan ekstrak gubal dari umbi teki, kemudian dilakukan penambahan amonium sulfat sebanyak 74,6 g. Protein yang ada dalam ekstrak gubal diendapkan secara bertingkat dengan penambahan garam amonium sulfat. Amonium sulfat adalah garam anion yang cukup efektif digunakan dalam pengendapan protein. Penambahan amonium sulfat harus dilakukan pada suhu 4 C karena sifatnya yang sangat larut pada suhu rendah. Penambahan juga dilakukan sedikit demi sedikit sambil terus diaduk dengan bantuan pengaduk magnetik bertujuan untuk menghindari amonium sulfat terkonsentrasi pada satu tempat. Tahap berikutnya, ekstrak gubal di-stirrer semalaman di dalam almari es dan dilanjutkan sentrifugasi pada 2010 xG selama 20 menit maka akan diperoleh supernatan dan endapan. Endapan yang diperoleh dilarutkan dalam sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM pada pH 7,2 dan selanjutnya didialisis sedangkan supernatannya ditampung untuk preparasi fraksi protein dengan derajat kejenuhan berikutnya. Proses dialisis dilakukan untuk memurnikan protein dari amonium sulfat dan melepaskan molekul kecil lainnya yang dianggap kontaminan protein. Sampel dimasukkan pada membran dialisis dan direndam dalam larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 dalam beaker glass. Penggantian larutan dapar perlu dilakukan untuk menjaga gradien konsentrasi amonium sulfat di dalam dengan di luar membran dialisis tetap besar sehingga mekanisme difusi pasif tetap berjalan. Pada penelitian ini dilakukan penggantian larutan dapar sebanyak 1 kali diharapkan tidak ada lagi amonium sulfat yang tersisa. Supernatan hasil dialisis ini merupakan sampel FP 20 umbi teki. Dengan pengerjaan yang sama akan diperoleh berturut-turut sampel FP 40 , FP 60 , dan FP 80 umbi teki. Untuk menentukan jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mendapatkan FP 20 , FP 40 , FP 60 , dan FP 80 dilakukan perhitungan berdasarkan rumus pada Lampiran 3. Pada preparasi sampel selanjutnya, jumlah amonium sulfat yang ditambahkan berturut-turut untuk mendapatkan sampel fraksi protein umbi teki FP 40 , FP 60 , dan FP 80 dengan pengendapan amonium sulfat adalah sebanyak 79,4 g untuk 700 ml supernatan ; 87,2 g untuk 720 ml supernatan ; dan 98,8 g untuk 760 ml supernatan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI