WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN Kadar air

27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3. Identifikasi Diterpenoid

Sebanyak 0,5 mg ekstrak dilarutkan dalam air dan ditambahkan 10 tetes tembaga asetat Cu 2 SO 4 . Terbentuk warna hijau emerald menunjukkan ekstrak mengandung diterpenoid Godghate, Asvin et al, 2012.

4. Identifikasi Tanin dan Polifenol

Sebanyak 3 g sampel diekstraksi aquades panas kemudian didinginkan. Setelah itu ditambahkan 5 tetes NaCl 10 dan disaring. Filtrat dibagi 3 bagian A, B, dan C. Filtrat A digunakan sebagai blangko, ke dalam filtrat B ditambahkan 3 tetes pereaksi FeCl 3 , dan ke dalam filtrat C ditambah garam gelatin. Kemudian diamati perubahan yang terjadi Marliana et al, 2005.

5. Identifikasi Saponin

Uji Saponin dilakukan dengan metode Forth yaitu dengan cara memasukkan 2 mL sampel kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10 mL akuades lalu dikocok selama 30 detik, diamati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk busa yang mantap tidak hilang selama 30 detik maka identifikasi menunjukkan adanya saponin. Uji penegasan saponin dilakukan dengan menguapkan sampel sampai kering kemudian mencucinya dengan heksana sampai filtrat jernih. Residu yang tertinggal ditambahkan kloroform, diaduk 5 menit, kemudian ditambahkan Na2SO4 anhidrat dan disaring. Filtrat dibagi menjadi menjadi 2 bagian, A dan B. Filtrat A sebagai blangko, filtrat B ditetesi anhidrat asetat, diaduk perlahan, kemudian ditambah H2SO4 pekat dan diaduk kembali. Terbentuknya cincin merah sampai coklat menunjukkan adanya saponin Marliana et al, 2005. 28 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

6. Identifikasi Steroid

Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 2 ml asam asetat anhidrat. Kemudian ditambahkan 2 ml H 2 SO 4 pekat. Adanya steroid ditandai dengan terbentuknya warna hijau Edeoga et al, 2005.

3.4.3. Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik

1. Parameter Spesifik

a. Identitas ekstrak dengan deskripsi tata nama sebagai berikut:  nama ekstrak,  nama latin tumbuhan sistematika botani,  bagian tumbuhan yang digunakan,  nama Indonesia tumbuhan Depkes RI, 2000. b. Organoleptik diamati menggunakan panca indera untuk mendeskripsikan bentuk, warna, bau, rasa sebagai berikut:  bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair,  warna : kuning, coklat dan lain-lain,  bau : aromatik, tidak berbau, dan lain-lain,  rasa : manis, pahit, khelat, dan lain-lain Depkes RI, 2000.

2. Parameter Non Spesifik

a. Kadar air

Masukkan lebih kurang 10 gram ekstrak dan ditimbang saksama dalam wadah yang telah ditara. Keringkan pada suhu 105 o C selama 5 jam dan ditimbang. Lanjutkan pengeringan dan timbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,25 Depkes RI, 2000. 29 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

b. Kadar abu

Sebanyak 2 gram ekstrak yang telah digerus dan timbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan kemudian ditimbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa kertas dan kertas saring dalam kurs yang sama. Masukkan filtrat ke dalam kurs, uapkan. Kemudian pijarkan hingga bobot tetap, lalu ditimbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 2000.

3.4.4. Uji Kualitatif Andrographolide dengan KLT Densitometri

Pengujian secara kualitatif dengan KLT dilakukan dengan menyiapkan larutan uji 100 mg5mL dalam etanol. Sebagai fase gerak adalah kloroform P : metanol P 9 : 1. Fase diam menggunakan plat KLT silika gel 60 F 254 . Volume penotolan larutan uji sebanyak 20 μl. Pengamatan noda pada UV 254 . Setelah penotolan di plat KLT ditunggu beberapa menit hingga plat KLT kering. Setelah kering spot atau bercak yang terelusi dilihat dibawah lampu UV 254 nm dan UV 366 nm. Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menggunakan KLT Densitometri Menkes, 2009.

3.4.5. Persiapan Hewan Uji

Tikus jantan galur Sprague-Dawley diaklimatisasi di Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan selama tiga minggu agar dapat menyesuaikan dengan lingkungannya yang baru. Selama proses adaptasi, diberi makan dan minum ad libitum. Tikus yang digunakan adalah tikus yang sehat dan secara visual menunjukkan perilaku yang normal. 30 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.6. Pemberian Perlakuan

Penelitian ini menggunakan 25 ekor tikus jantan galur Sprague- Dawley yang diberikan 5 perlakuan yang berbeda. Masing-masing perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus jantan. Ekstrak etanol 96 daun sambiloto yang diperoleh didispersikan dalam pembawa Tween 80 2, diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari selama 48 hari dengan dosis seperti tertera pada tabel rancangan percobaan.

3.4.7. Pembuatan Preparat

Setelah 48 hari yaitu pada hari ke-49, masing-masing hewan coba dikorbankan untuk diambil testisnya. Tikus dibius dengan eter, kemudian dibedah. Diambil bagian kauda epididimis untuk pengamatan motilitas sperma dan aktivitas spermisidal, dan bagian testis diambil untuk ditimbang berat testis dan dibuat preparat histologi. Pembuatan preparat histologi testis dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

3.4.8. Pengukuran Parameter

1. Pengukuran Bobot Testis

Dilakukan dengan cara menimbang organ testis dengan menggunakan timbangan analitik. Kemudian hasil bobot testis tikus yang diberi perlakuan dibandingkan dengan bobot testis tikus kontrol.

2. Motilitas Spermatozoa

Pengamatan motilitas spermatozoa dilakukan dengan cara mencampurkan satu tetes semen dari kauda epididimis dengan disayat dan dipencet perlahan dengan 1 ml NaCl fisiologis 0,9 di atas kaca arloji secara merata. Kemudian dari campuran tersebut diambil sedikit dan diteteskan di atas Neubauer untuk selanjutnya dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan pembesaran objektif 40 kali. Motilitas sperma diamati dan dihitung dengan enam lapang pandang yang secara berurutan digeser dari kiri ke kanan, kemudian dihitung 31 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta persentase spermatozoa yang motil dengan cara spermatozoa yang bergerak ke depan dibandingkan dengan yang tidak bergerak atau bergerak di tempat Nurcholidah et al., 2013.

3. Pengukuran Diameter Tubulus Seminiferus

Dilakukan dengan membuat preparat histologi testis tikus terlebih dahulu, menggunakan salah satu testis bagian kanan Jain, Sachin., et all. 2012. Setelah itu, preparat histologi diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x, 20 tubulus dipilih secara random diukur menggunakan mikrometer okuler Malihezaman, Monsefi dan Pahlavan Sara. 2007. Tubulus seminiferus yang diukur diameternya yaitu jarak antara dua titik yang berseberangan pada garis tengahnya, titik tersebut berada pada membran basalis tubulus seminiferus Adriani, 2012.

4. Aktivitas Spermisidal

 Preparasi sperma Tikus yang digunakan adalah tikus yang fertil. Tikus kemudian dikorbankan untuk mengambil kauda epididimis kemudian semen dikumpulkan dan diinkubasi dengan normal saline water untuk uji in vitro dari sperma tikus. Sperma yang digunakan mempunyai motilitas ≥50 Ashish Ranjan Singth, 2013.  Uji aktivitas spermisidal Aktivitas spermisidal ditentukan dengan menggunakan versi modifikasi dari protokol asli Sander dan Metode Cramer yang mengukur konsentrasi minimum zat spermisida yang dibutuhkan untuk membunuh 100 sperma dalam 20 detik. Ekstrak etanol 96 daun sambiloto dengan berbagai konsentrasi dicampur dengan suspensi sperma. Campuran diamati di bawah mikroskop selama 20 detik di perbesaran 32 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 40X dan diamati motilitas sperma. Konsentrasi dicatat jika ada sperma motil yang terlihat, lalu 250 μL buffer ditambahkan ke semua campuran dan diinkubasi pada suhu 37°C selama minimal 60 menit. Larutan tersebut perlahan-lahan di vortex dan diamati lagi setiap sperma yang motil. Konsentrasi dicatat sebagai hasil yang efektif jika kedua tes menunjukkan tidak adanya sperma motil. Titik akhir adalah konsentrasi terendah dari ekstrak daun sambiloto yang menyebabkan imobilisasi semua sperma dalam 20 detik pencampuran Ashish Ranjan Singth, 2013.

3.5. Analisis Data

Data percobaan dinyatakan sebagai mean ± SD. Data dianalisis untuk melihat penurunan aktivitas spermisidal pada kelompok yang diberi perlakuan. Analisis data secara statistik menggunakan program SPSS 16 meliputi uji normalitas, uji homogenitas, uji parametrik one-way ANOVA atau non parametrik Kruskal Wallis. Jika hasil dari uji ANOVA maupun Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan yang nyata P ≤ 0,05 maka analisis data dilanjutkan menggunakan uji Least Significant Difference LSD. 33 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL PENELITIAN

4.1.1 Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor – LIPI. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman uji adalah benar tanaman sambiloto Andrographis paniculata Burm.f. Nees suku Acanthaceae. Surat pernyataan hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.

4.1.2 Ekstraksi

Dari 15 kg daun segar sambiloto Andrographis paniculata Burm.f. Nees diperoleh 1,1 kg simplisia daun kering dan ± 1 kg serbuk halus daun sambiloto Andrographis paniculata Burm.f. Nees. Serbuk daun sambiloto dimaserasi sebanyak enam kali berulang dengan menggunakan pelarut etanol 96 sebanyak 6,5 L hingga dihasilkan maserat yang berwarna lebih bening daripada maserat awal. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan vacum rotary evaporator menghasilkan ekstrak kental sebanyak 120,925 gram dengan rendemen sebesar 12,093. Perhitungan rendemen dapat dilihat pada lampiran 5.

4.1.3 Penapisan Fitokimia Ekstrak

Hasil penapisan fitokimia ekstrak etanol 96 daun sambiloto Andrographis paniculata Burm.f. Ness ditunjukkan pada tabel 4.1.