UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 C selama 30
menit.
3.3.5 Inokulasi Bakteri pada Media Pseudomonas Isolation Agar PIA
padat Deby et al., 2012
Inokulasi dilakukan untuk memindahkan dan meremajakan bakteri.Teknik yang digunakan adalah Streak Plate. Jarum ose dipanaskan
terlebih dahulu sampai berpijar, lalu didinginkan, kemudian buka mulut cawan yang berisi kultur bakteri P.aeruginosa dan bakteri diambil dengan
cara menggoreskan ose ke inokulum, lalu tutup mulut cawan dan panaskan kembali. Ose digoreskan pada media Pseudomonas Isolation Agar PIA
padat dengan metode gores kontinyu, kemudian tutup mulut cawan dan panaskan kembali di api, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37
C selama 24 jam.
3.3.6 Karakterisasi bakteri Pseudomonas aeruginosa
Karakterisasi bakteri P.aeruginosa dilakukan dengan cara pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram dilakukan dengan tujuan untuk
mengidentifikasi isolat bakteri yang akan digunakan dalam penelitian. Bahan yang digunakan pada pewarnaan Gram adalah safranin, lugol, kristal
violet, etanol 70, NaCl fisiologis. Goreskan sedikit isolat bakteri dengan menggunakan ose dan diusapkan sedikit ke kaca objek, lalu tambahkan
sedikit NaCl fisiologis pada isolat untuk membuat suspensi bakteri. Keringkan suspensi bakteri dan lakukan fiksasi di atas api bunsen, kemudian
tambahkan satu tetes kristal violet dan diamkan selama satu menit, bilas dengan air keran lalu tambahkan satu tetes lugol dan diamkan selamat satu
menit dan kembali bilas dengan etanol 70. Tambahkan satu tetes safranin lalu bilas dengan air keran dan keringkan menggunakan mikroskop.
3.3.7 Pembuatan Suspensi Bakteri
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Bakteri P.aeruginosa yang telah diremajakan di media Pseudomonas Isolation Agar PIA padat diambil dengan jarum ose dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi media heterotrof HTR cair 10 lalu dikocok-kocok sampai lepas. Tabung reaksi divortex selama 1 menit,
kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C. Setelah diinkubasi selama 24 jam, diukur nilai absorbansi pada panjang 600 nm menggunakan
spektrofotometri untuk mengetahui konsentrasi suspensi bakteri tersebut.
3.3.8 Uji Pembentukan dan Pertumbuhan Biofilm Bakteri P. aeruginosa
Prasasti and Hertiani, 2010
Uji pembentukan dan pertumbuhan biofilm bakteri P.aeruginosa dilakukan untuk mengetahui berapakah waktu yang dibutuhkan
P.aeruginosa untuk membentuk biofilm yang paling baik. Uji pertumbuhan biofilm P.aeruginosa dilakukan dengan metode Microtitter Plat Biofilm
Assay. Sebanyak 100 µL suspensi bakteri P.aeruginosa OD 0,5 dan 100 µL media Heterotrof HTR cair dimasukkan ke dalam sumur microplate,
kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 1 hari, 2 hari, 3 hari dan 4 hari.
Setelah diinkubasi, cuci microplate dengan menggunakan air yang mengalir sebanyak 3 kali dan keringkan, kemudian masukkan larutan kristal violet
1 sebanyak 200 µL dan didiamkan selama 15 menit. Setelah itu cuci kembali microplate dengan air mengalir sebanyak 3 kali dan keringkan, lalu
masukkan etanol 96 sebanyak 200µL dan diamkan selama 15 menit, kemudian dilakukan pembaca Optical Density OD biofilm P.aeruginosa
menggunakan alat iMark-Biorad Microplate Reader pada panjang gelombang 595nm.
3.3.9 Uji Aktivitas Antibiofilm Secara In Vitro Sandasi et al., 2010;
Prasasti dan Hertiani, 2010 Pencegahan Pertumbuhan Biofilm
Pembentukan biofilm pada penelitian ini diuji secara in vitro menggunakan metode Microtitterplate flat-buttom polystyrene 96 wells.
Kategori