Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Dan diinkubasi kembali dengan inkubator goyang selama 3 jam pada suhu 37⁰C 150 rpm. Selanjutnya hasil kultur dipindahkan dalam tube 50 ml vortex terlebih dahulu kemudian di sentrifus dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Endapan dicuci dengan media LB dan disentrifus kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan diperoleh pelet simpan pada suhu -20⁰C selama satu malam. Proses selanjutnya adalah purifikasi, pelet yang diperoleh dilakukan freeze thawing atau pengeringbekuan sebanyak tiga kali. Setelah itu dilakukan sonikasi pemecahan sel dengan menggunakan sonikator amplitudo 40 cycle 0,5 selama 15 detik, dilakukan tiga kali dengan interval 1 menit. Selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 7000 rpm selama 20 menit. Supernatan dipindahkan dalam tube 50 ml dan pelet disimpan pada suhu -20⁰C. Sedangkan supernatan ditambahkan resin TALON 200 µl kemudian diletakkan pada rotary cold room selama 3 jam. Supernatan disentrifus selama 7 menit kecepatan 3500 rpm. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 10 ml dapar B diaduk secara perlahan dan disentrifus kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan dibuang kembali, pelet ditambahkan 10 ml dapar B dan disentrifus kembali selama 3 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan dibuang kembali, pelet diaduk perlahan dipindahkan dalam tube 1,5 ml, kemudian ditambahkan 100 µl dapar elusi dan diletakkan pada rotary cold room selama satu malam. Kemudian disentrifus kembali selama 1 menit, 3500 rpm. Endapan dicuci dengan 100 µl larutan dapar elusi dan diletakkan pada rotary cold room selama satu jam. Kemudian disentrifus kembali selama 1 menit, 3500 rpm. Setelah itu larutan enzim dan resin dipisahkan dan disimpan pada suhu 4⁰C.

3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE

Semua alat disiapkan, plat kaca yang digunakan terdiri atas short plate dan spacer plate dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70. Short plate ditempatkan pada bagian depan kaca spacer yang sebelumnya diberi casting frame pada bagian tengah dan dikunci dengan menggunakan 22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta casting stand. Selanjutnya dibuat larutan separating gel 8 lampiran 8a. Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate sampai terisi dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan aquades hingga penuh. Ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit. Setelah terbentuk gel dibuat larutan gel stacking 8 lampiran 8b. Aquades pada separating dibuang dan dimasukkan larutan stacking pada sepertiga bagian celah. Dan dipasangkan comb, tunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit. Gel dipindahkan dari casting frame, gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, dan ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan larutan dapar elektroforesis SDS 1x pH 8,3. Sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase HCV ditampung dalam tube 1,5 ml meliputi pelet, supernatan, inner volum, washing, elusi enzim dan resin. Masing-masing sampel yang diambil 20 µl dan ditambahkan 10 µl loading dye lampiran 8c kemudian dilakukan denaturasi yaitu dipanaskan didalam waterbath pada suhu 90⁰C selama 15 menit. Masing-masing sampel tersebut dimasukkan kedalam well sebanyak 15 µl. Marker protein BIORAD ® sebanyak 4 µlgel dimasukan ke dalam well. Kemudian gel di elektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining comassie blue G-250 lampiran 8d selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker. Kemudian gel dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining lampiran 8e ± 30 menit, dan dibilas dengan aquades hingga bau asam hilang, diletakkan didalam kertas mika kemudian di scan.

3.3.10 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C Utama et al,