35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.1. Hasil SDS PAGE RNA Helikase HCV Keterangan : S= Supernatan, W1= Washing 1, IV= Inner Volume, M= Marker,
E1= Elusi 1
4.7 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA
Helikase HCV
Setelah diperoleh enzim RNA helikase murni selanjutnya dilakukan uji aktivitas inhibisi ekstrak metanol kulit buah manggis terhadap RNA
helikase HCV dengan menggunakan metode kolorimetri ATPase. Uji kolorimetri ATPase digunakan untuk menguji aktivitas enzim yang
bergantung pada keberadaan ATP sebagai sumber energi dan melibatkan pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA
helikase. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan
Pi fosfat anorganik. Tahap awal dilakukan dengan mengencerkan ekstrak metanol kulit
buah manggis dengan methanol absolut. Kemudian sampel ditambahkan pada setiap well sebanyak 5 µl yang sebelumnya telah terisi larutan master mix
sebanyak 45 µl yang terdiri dari air suling, MOPS, MgCl
2
, dan ATP serta enzim RNA helikase yang telah diencerkan dengan aquades. ATP adenosin
36
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
trifosfat merupakan substrat pada pengujian ATPase kolorimetri, MOPS asam 4-morfolinopropana sulfonat berperan sebagai dapar dalam larutan
master mix. MgCl
2
berfungsi sebagai kofaktor RNA helikase, dan air suling sebagai pelarut Utama et al, 2000.
Larutan pewarna yang ditambahkan pada reaksi ini merupakan indikator pada reaksi pengujian. Larutan pewarna malachite green terdiri dari
ammonium molibdat yang berikatan dengan fosfat anorganik yang terhidrolisis menghasilkan kompleks fosfomolibdat dan malachite green.
Semakin banyak jumlah kompleks fosfomolibdat dan malachite green, maka semakin pekat warna yang dihasilkan hijau tua, begitu pula sebaliknya,
Semakin sedikit jumlah kompleks fosfomolibdat dan malachite green, maka semakin encer warna yang dihasilkan hijau muda.
Pada reaksi ini juga dibuat larutan blanko yaitu larutan master mix tanpa penambahan enzim RNA helikase sehingga tidak dihasilkan fosfat
bebas yang menyebabkan tidak terbentuknya kompleks fosfomolibdat dan malachite green sehingga warna yang dihasilkan lebih muda. Uji aktivitas
inhibisi secara kolorimetri dilakukan dengan mengukur panjang gelombang pada reaksi antara enzim RNA helikase dan ekstrak kulit buah manggis
menggunakan microplate reader. Absorbansi diukur pada dua panjang gelombang, yaitu panjang
gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 optimum untuk penyerapan warna kebiruan, sedangkan panjang gelombang 405 nm optimum
untuk penyerapan warna kekuningan. Kedua panjang gelombang ini digunakan agar perhitungan reaksi antara RNA helikase dengan ATP lebih
akurat. Perhitungan konsentrasi fosfat anorganik yang terinhibisi oleh sampel menggunakan perbandingan kedua panjang gelombang tersebut Chan et al,
1986. Reaksi warna di hentikan dengan penambahan natrium sitrat pada
campuran reaksi. Natrium sitrat berfungsi mencegah terbentuknya reaksi enzimatis yang berlebihan.
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.2. Kurva Inhibisi Ekstrak Metanol Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV
Dari gambar diatas, menyatakan bahwa ekstrak metanol kulit buah manggis memiliki aktivitas yang masih rendah dalam menghambat enzim
RNA helikase virus hepatitis C secara invitro menggunakan uji kolorimetri ATPase dengan persentase 66,28 pada konsentrasi yang masih tinggi
5.000 ppm. Sedangkan pada konsentrasi 10.000 ppm tidak dapat dibaca pada uji kolorimetri ATPase dikarenakan masih menggumpal sehingga
perlu dilakukan pengenceran. Pelarut yang digunakan pada uji kolorimetri ATPase adalah metanol.
Metanol secara kimia merupakan zat denaturan pada enzim, namun selama dalam konsentrasi kecil maka metanol tidak mengganggu kerja enzim
helikase dalam menginhibisi virus. Metanol dikontrol dengan cara menjadikannya sebagai kontrol negatif, sehingga hasil akhir dari persen
penghambatan dikurangi dengan kontrol negatif agar diperoleh nilai persen yang sesungguhnya dari senyawa inhibitor ekstrak kulit buah manggis
Garcinia mangostana L..
4.8 Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak
