22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
casting stand. Selanjutnya dibuat larutan separating gel 8 lampiran 8a. Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate
sampai terisi dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan aquades hingga penuh. Ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit.
Setelah terbentuk gel dibuat larutan gel stacking 8 lampiran 8b. Aquades pada separating dibuang dan dimasukkan larutan stacking pada
sepertiga bagian celah. Dan dipasangkan comb, tunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit. Gel dipindahkan dari casting frame, gel cassette
sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, dan
ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan larutan dapar
elektroforesis SDS 1x pH 8,3. Sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase HCV ditampung
dalam tube 1,5 ml meliputi pelet, supernatan, inner volum, washing, elusi enzim dan resin. Masing-masing sampel yang diambil 20 µl dan
ditambahkan 10 µl loading dye lampiran 8c kemudian dilakukan denaturasi yaitu dipanaskan didalam waterbath pada suhu 90⁰C selama 15
menit. Masing-masing sampel tersebut dimasukkan kedalam well sebanyak
15 µl. Marker protein BIORAD
®
sebanyak 4 µlgel dimasukan ke dalam well. Kemudian gel di elektroforesis pada 40 mA selama 90 menit.
Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining comassie blue G-250 lampiran 8d
selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker. Kemudian gel dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining
lampiran 8e ± 30 menit, dan dibilas dengan aquades hingga bau asam
hilang, diletakkan didalam kertas mika kemudian di scan.
3.3.10 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C Utama et al,
2000
Uji aktivitas enzim helikase berdasarkan metode ATPase kolorimetri. Langkah pertama dibuat pengenceran enzim 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x,
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pengenceran yang dilakukan menggunakan MOPS 10 mM. Kemudian pembuatan larutan master mix yang terdiri dari ddH2O, MOPS 0.1 M,
MgCl
2
0.1 mM, dan ATP 0.1 mM. Selanjutnya dilakukan pengujian dengan cara mengisi tiap microtiter plate 96-well dengan 5 µl pengenceran enzim
dan 45 µl master mix. Untuk blanko, diisi 5 µl aquades dan 45 µl master mix. Semua pengujian dilakukan secara triplo.
Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Setelah pada menit ke-35 dibuat larutan pewarna yang terdiri dari
0.081 malakit hijau, H2O, 5.7 amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah masa
inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan dalam tiap well sebanyak 100 µl, dan kemudian dilakukan inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang.
Setelah masa inkubasi selesai ditambahkan 25 µl Na sitrat untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Selanjutnya hasil reaksi diukur dengan
menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm.
3.3.11 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom Kromatografi
Pemisahan tahap awal ekstrak kental kulit buah manggis Garcinia mangostana L. menggunakan kolom kromatografi dengan diameter 2,54
cm dan panjang kolom 65 cm. Kolom kromatografi yang telah dibersihkan, disiapkan dengan memberi kapas pada ujung kolom untuk menahan silika
gel agar tidak keluar, dipasang tegak lurus pada statif. Selanjutnya silika gel ditimbang sebanyak 100 g, dilarutkan dengan pelarut organik nonpolar
kloroform hingga diperoleh silika dengan konsentrasi seperti bubur, diaduk hingga terbentuk suspensi.
Bubur silika dimasukkan kedalam kolom sambil diketuk-ketuk agar silika memadat didalam kolom serta dialiri pelarut kloroform didalam
kolom, pelarut ditampung dan dimasukkan kembali. Dilakukan secara berulang-ulang sehingga silika gel menjadi padat didalam kolom. Ekstrak
metanol kulit buah manggis sebanyak 4 g dilarutkan dengan pelarut metanol
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sebanyak 4 ml. Selanjutnya dimasukkan secara hati-hati kedalam kolom pada bagian atas dengan cara dialirkan melalui dinding kolom.
Pemisahan ekstrak metanol kulit buah manggis dengan menggunakan pelarut gradien kloroform-metanol dengan perbandingan 9:1, 8:2, 7:3, 6:4,
5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9. Sebanyak 4 ml eluat ditampung didalam masing- masing vial. Masing-masing fraksi diuapkan dari eluennya untuk kemudian
diuji aktivitas inhibisi RNA helikase virus hepatitis C dengan menggunakan uji ATPase kolorimetri Mustopa et al, 2012.
3.3.12 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA
