30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Heinrich, 2009. Pada identifikasi senyawa terpenoid memberikan hasil yang positif ditandai dengan adanya warna merah kecoklatan diantara
lapisan kloroform dan asam sulfat yang ditambahkan kedalam ekstrak.
4.4 Parameter dan Metode Uji Ekstrak
Parameter dan metode uji ekstrak yang dilakukan terhadap ekstrak kulit buah manggis dapat dilihat dari tabel 4.2.
Tabel 4.2 Parameter dan Metode Uji Ekstrak Parameter Uji Ekstrak
Ekstrak Metanol Menurut Literatur
Parameter Non spesifik : a.
Susut pengeringan b.
Kadar abu Parameter Spesifik :
a. Parameter Identitas Ekstrak - Nama lain Tumbuhan
- Bagian yang digunakan - Nama Indonesia
tumbuhan b. Organoleptik
- Bentuk - Warna
18,41 1,388
Mangi, manggi,
manggus, manggista Kulit Buah pericarp
Manggis
Ekstrak kental Coklat
4 MMI jilid V, 1989
Parameter uji ekstrak meliputi dua aspek: 1 aspek parameter spesifik yang berfokus pada senyawa atau golongan senyawa yang bertanggung
jawab terhadap aktivitas farmakologis. 2 aspek parameter non spesifik yang berfokus pada aspek kimia, mikrobiologi dan fisis yang akan mempengaruhi
keamanan konsumen dan stabilitas misal kadar logam, aflatoksin, kadar air, dan lain-lain Saifudin, 2011.
Pada pengujian kadar abu dimaksudkan untuk menentukan karakteristik sisa kadar abu nonorganik setelah pengabuan. Pada prinsipnya
dengan memanaskan ekstrak pada temperatur di mana senyawa organik dan
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
turunannya terdestruksi dan menguap, sehingga hanya ada sisa kadar abu nonorganik. Nilai kadar abu yang diperoleh adalah 1,388 , persyaratan
batas kadar abu untuk ekstrak buah manggis pada buku Materia Medika jilid V adalah tidak lebih dari 4 . Hal ini menandakan bahwa ekstrak
memenuhi persyaratan kadar abu yang dianjurkan. Pada uji parameter susut pengeringan untuk memberikan batasan
maksimal rentang tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Nilai susut pengeringan yang diperoleh adalah 18,41 . Hal
ini menandakan tingginya kadar senyawa yang hilang selama proses pengeringan baik berupa air, sisa pelarut dan senyawa yang mudah menguap
lainnya.
4.5 Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C
Pada penelitian ini produksi enzim RNA helikase dilakukan untuk mendapatkan enzim RNA helikase virus hepatitis C yang dihasilkan oleh
bakteri Escherichia coli BL21 DE3 pLysS. Dan kemudian akan digunakan untuk menguji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap enzim
RNA helikase virus hepatitis C. Ekspresi RNA helikase virus hepatitis C dimulai dengan tahapan pre
kultur yang dilakukan dalam media cair Luria Bertani LB yang merupakan media kompleks yang terdiri dari tripton, ekstrak khamir, dan natrium
klorida dan merupakan media yang cocok untuk pertumbuhan bakteri. Ampisilin yang ditambahkan pada media LB berfungsi sebagai penghambat
bagi pertumbuhan bakteri lain sehingga hanya bakteri Escherichia coli yang membawa gen RNA helikase virus hepatitis C yang dapat tumbuh pada
media tersebut. Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 37⁰C dengan
kecepatan 150 rpm selama semalam, kondisi ini merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri Pelzar Chan, 1986. Selanjutnya
hasil prekultur dipindahkan ke medium LB 400 ml yang sebelumnya telah ditambahkan ampisilin dan diinkubasi kembali pada suhu 37⁰C dengan
kecepatan 150 rpm hingga diperoleh nilai OD
600
Optical Density mencapai
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
0,3 atau pada saat bakteri mencapai fase logaritmik, karena fase ini merupakan fase awal di mana bakteri Escherichia coli tumbuh. Kultur
ditambahkan IPTG
Isopropyl- β-D-Thiogalaktopiranosidase
yang bertujuan untuk menginduksi gen RNA helikase virus hepatitis C agar
terjadi ekspresi berlebih. Sehingga dihasilkan jumlah enzim RNA helikase yang lebih besar hingga fase awal stasioner di mana nilai OD
600
mencapai 1 Utama et al, 2000.
Pengumpulan pelet bakteri E. coli dengan cara disentrifugasi pada suhu 4⁰C dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit untuk memisahkan
sel E. coli dengan media LB. Pelet yang telah terkumpul disimpan pada suhu -20⁰C untuk menjaga stabilitas RNA helikase HCV. Proses selanjutnya
adalah purifikasi enzim RNA helikase virus hepatitis C yang bertujuan untuk memurnikan hasil ekspresi protein RNA HCV yang telah disisipkan
dalam bakteri E. coli BL 21 DE3 pLysS. Proses purifikasi diawali dengan pemecahan sel yang terdiri atas dua
metode yaitu pengeringbekuan dan sonikasi. Proses pengeringbekuan dan sonikasi dalam purifikasi RNA helikase bertujuan untuk memecah sel
bakteri rekombinan
karena RNA
helikase bersifat
intraseluler. Pengeringbekuan dilakukan dengan menempatkan sel secara bergantian
pada suhu -20⁰C dan suhu ruang, masing-masing selama 30 menit sebanyak tiga kali pengulangan. Proses pengeringbekuan ini menyebabkan
melunaknya dinding sel bakteri sehingga mempermudah proses pemecahan sel.
Metode berikutnya adalah sonikasi dengan menggunakan sonikator, enzim RNA helikase HCV disuspensikan terlebih dahulu dengan dapar B
10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25 Tween 20. Tris HCl berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA helikase
sehingga stabilitasnya
terjaga, natrium
klorida berperan
untuk menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik
dengan RNA helikase Vanz et al, 2008. Sedangkan tween 20 merupakan detergen non-ionik yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sel. Metode sonikasi ini akan merusak organel dalam sel namun tidak merusak integritas kemampuan fungsionalnya.
Hasil sonikasi selanjutnya di sentrifugasi untuk memisahkan metabolit intraseluler dan ekstraseluler. Supernatan berupa metabolit intraseluler
dimurnikan kembali dengan resin TALON dan dibiarkan selama 3 jam didalam cold rotary room, resin TALON akan mengikat RNA helikase,
pengikatan dilakukan oleh logam Co
2+
yang terdapat dalam resin TALON. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan
metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit.
Proses terakhir dari purifikasi adalah pencucian dengan menggunakan dapar B dan disentrifugasi kembali pada temperatur 4°C kecepatan 3500
rpm selama 7 menit. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular.
Pelet ditambahkan dapar elusi imidazol dalam dapar B untuk menghilangkan protein selain enzim RNA helikase. Imidazol yang terdapat
dalam dapar elusi ini akan memutus ikatan antara RNA helikase dengan resin TALON dan selanjutnya disentrifugasi kembali. Sentrifugasi pada
temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit digunakan untuk memisahkan imidazol dengan enzim yang telah murni. Penggunaan
kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya Sambrook Russel, 2001.
4.6 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE
