Gejala Internal Analisis Pengamatan Mikroskopis Histopatologi

71 6 PEMBAHASAN UMUM Dalam budidaya tanaman jeruk keprok SoE JKS sering dihadapkan dengan beberapa masalah, seperti serangan penyakit. Penyakit yang dapat menyerang tanaman jeruk salah satunya adalah penyakit Huanglongbing atau di Indonesia disebut dengan citrus vein phloem degeneration CVPD. Masalah penyakit tersebut dapat ditangani dengan menggunakan teknik pemuliaan tanaman untuk mendapatkan tanaman yang tahan terhadap penyakit. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan tanaman tahan terhadap penyakit Huanglongbing melalui perpaduan beberapa metode dalam pemuliaan tanaman non-konvensional Bioteknologi, seperti teknik produksi tanaman secara in vitro melalui sistem regenerasi embriogenesis somatik menghasilkan keturunan yang true-to-type dalam jumlah relatif banyak, dan peningkatan keragaman genetik tanaman dengan teknik mutasi untuk perbaikan sifat-sifat tanaman IAEA 1991; Majd et al. 2009, khususnya sifat tahan terhadap penyakit Huanglongbing. Penelitian diawali dengan proses menghasilkan kalus embriogenik secara in vitro dari biji matang mature seed JKS. Kalus embriogenik yang telah diperbanyak, sebagian diregenerasikan membentuk planlet melalui sistem embriogenesis somatik, dan sebagian diiradiasi dengan sinar gamma untuk mendapatkan kalus embriogenik M1. Kalus embriogenik M1 selanjutnya diregenerasikan juga melalui embriogenesis somatik untuk mendapatkan individu- individu tanaman MV1. Biji matang mature seed tanaman jeruk memiliki bakal biji yang telah berkembang, terdiri atas integument yang telah mengeras membentuk seed coat kulit biji, embrio nuselar yang terdegenerasi dari jaringan nuselus, dan kantung embrio yang membesar dan endosperm yang semakin berkurang sesuai ukuran kotiledon embrio zigotik jeruk. Biji matang mature seed berbeda dengan biji yang masih muda immature seed. Biji muda tanaman jeruk kelas dikotil memiliki bakal biji ovule yang terdiri atas integumen yang masih lunak, jaringan nuselus megasporofit yang masih melingkupi kantung embrio, dan kantung embrio embryo sacmegagametofit yang ukurannya masih kecil dan lunak Zimmerman 1993; Koltunow et al. 1995. Embrio somatik JKS diinduksi pembentukannya dari biji matang secara tidak langsung melalui pembentukan kalus embriogenik. Dalam penelitian ini, media induksi kalus embriogenik tersebut menggunakan media dasar MS yang dimodifikasi dengan vitamin MW dengan penambahan zat pengatur tumbuh BAP dengan konsentrasi 3 mg L -1 . Kalus embriogenik terbentuk dalam waktu tiga bulan setelah inokulasi eksplan pada media tersebut. Kalus embriogenik KE diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 20-40 kali. KE terdiri atas massakompleks pro-embrio PEM: pro- embryo mass dan globular-globular muda early globular. Massa pro-embrio yang berupa sel-sel atau individu-individu sel dalam jumlah yang sangat banyak tersebut seperti gumpalan awan atau kapas berwarna putih. Struktur berbentuk awan atau kapas tersebut bila dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali maka akan terlihat penyusunnya adalah individu-individu dengan jumlah sel yang bervariasi, satu, dua, empat, delapan atau enambelas sel. 72 PEM kemudian terus bertumbuh dan berkembang melalui pembelahan sel secara mitosis membentuk apa yang disebut dengan sel yang kompeten 1 sel, pro-embrio tahap tetrad 2 sel, kuadran 4 sel, oktan 8 sel dan globular muda early globular 16 sel Zimmerman 1993. Struktur globular muda belum dapat dilihat dengan mata telanjang tapi dapat menggunakan mikroskop dengan pembesaran 20 kali. Dalam penelitian ini, pro-embrio berkembang menjadi globular muda early globular dan akan terus bertumbuh menjadi globular transisi late globular berupa globular dewasa yang dapat dilihat dengan mata telanjang dengan ukuran sekitar 10 mm 2 dan telah memiliki dua kutub bipolar. Globular transisi selanjutnya bertumbuh menjadi embrio somatik fase jantung dan torpedo; kemudian membentuk embrio somatik dewasa fase kotiledon, pada akhirnya berkecambah dan bisa membentuk planlet lengkap daun dan akar. Pro-embrio PEM dan embrio somatik ES dalam proses embriogenesis somatik, pada awal terbentuknya, memiliki suspensor yang terbentuk dari pembelahan sel mitosis secara asimetris Zimmerman 1993. Pertumbuhan dan perkembangan PEM dan ES selanjutnya proliferasi ES tidak lagi memiliki suspensor. Suspensor seperti yang dimiliki oleh embrio zigotik berfungsi dalam menyalurkan makanan dan membantu embrio zigotik masuk ke dalam endosperm. Kalus dinyatakan embriogenik apabila dilihat dengan mata telanjang nampak remah, terpisah-pisah, tidak menyatu, berwarna putih, putih kekuningan, kuning mengkilap, putih kehijauan atau kuning kehijauan. Dalam penelitian ini, tipe kalus embriogenik JKS bila dilihat di bawah mikroskop adalah campuran struktur pro-embrio PEM dan globular muda berwarna putih, putih kehijauan dan putih kekuningan. KE yang telah diiradiasi dengan sinar gamma dosis LD50 75 Gy, setelah disubkultur, tipe kalus yang nampak di bawah mikroskop hanya memperlihatkan struktur PEM saja, sehingga butuh banyak KE yang dikulturkan untuk mendapatkan planlet melalui embriogenesis somatik. Hasil di atas dapat dibandingkan dengan penelitian yang telah dilakukan oleh Husni et al. 2010 pada jeruk Siam Simadu dan Pontianak yang dikulturkan pada media MW dan MT. Tipe kalus jeruk Siam Simadu dan Pontianak memiliki struktur PEM dan globular Regenerasi KE membentuk planlet terdiri dari dua proses, yaitu proses pendewasaan KE membentuk ES dewasa; dan proses perkecambahan ES dewasa membentuk kecambah. Proses pendewasaan dan perkecambahan ES dapat terjadi pada medium MW tanpa penambahan zat pengatur tumbuh apapun. Namun, untuk mempersingkat waktu pembentukan dan meningkatkan jumlah, biasanya dapat ditambahkan zat pengatur tumbuh ABA untuk pendewasaan ES dan GA 3 untuk perkecambahan ES Purnamaningsih 2002; Husni et al. 2010; Merigo 2011; Wulansari 2013. Dalam penelitian ini, selain ditambahkan ABA dan GA 3 pada masing- masing proses pendewasaan dan perkecambahan, percobaan juga dilakukan dengan memanfaatkan air kelapa. Air kelapa dimanfaatkan karena selain mudah diperoleh di mana saja, juga karena harganya yang relatif lebih murah, dan yang terutama, air kelapa mengandung sejumlah besar kandungan kimia yang diperlukan dalam pertumbuhan dan perkembangan suatu calon tanaman. Kandungan kimia dalam air kelapa seperti vitamin C, gula, mineral kalium, natrium, kalsium Mandang 1993. 73 Perkembangan kalus embriogenik dipengaruhi oleh kondisi hormon endogen dan eksogen. Konsentrasi auksin lebih tinggi daripada sitokinin maka pertumbuhan akar lebih dominan, apabila konsentrasi sitokinin lebih tinggi daripada auksin maka yang dominan terbentuk adalah tunas. Dengan demikian apabila konsentrasi ZPT endogen dan eksogen dalam kondisi seimbang, pada komposisi media yang sesuai, maka akan dapat menghasilkan kalus ataupun kalus embriogenik. Kalus embriogenik JKS yang diperoleh pada tahap pertama penelitian ini, dipaparkan dengan iradiasi sinar gamma dengan tujuan untuk menginduksi terjadinya mutasi dari individu-individu masing-masing sel KE awal sehingga keragaman genetik menjadi lebih tinggi. KE adalah massa sel-sel, sehingga diharapkan iradiasi yang diterapkan dapat menjangkau sampai ke dalam genom secara keseluruhan. Berbeda dengan bila iradiasi yang dipaparkan pada bagian tanaman atau jaringan dengan ukuran yang lebih besar, akan memunculkan sifat kimera, apalagi sifat yang muncul adalah sifat yang tidak diinginkan, bahkan dapat merugikan disebabkan iradiasi tidak totalitas menjangkau keseluruhan genom tanaman. Sinar gamma digunakan karena memiliki kelebihan yaitu daya tembusnya yang lebih besar dan homogen dalam waktu yang singkat. Iradiasi gamma merupakan pilihan yang paling efisien dan efektif dalam proses induksi mutasi suatu bahan. Induksi mutasi dengan sinar gamma tersebut, bukan dimaksudkan untuk mengubah bentuk tanaman, tapi tujuannya hanya untuk mengubah atau memanipulasi sifat-sifat tertentu dari suatu jenis tanaman Sastrosumarjo et al. 2006; Pardal 2014. Sifat-sifat tersebut misalnya dari kurang tahan menjadi tahan atau sangat tahan terhadap serangan penyakit, atau mungkin akan muncul juga sifat-sifat ketahanan yang lain seperti, tahan terhadap kekeringan, naungan, lahan salin, dan sebagainya. Dosis iradiasi gamma yang diterapkan pada kalus embriogenik jeruk keprok SoE ini yang dapat menyebabkan terjadinya perubahan genetik pada individu tanamannya adalah pada dosis LD50 75 Gy. Dosis ini sebelumnya telah diterapkan oleh Karyanti 2013 untuk induksi terjadinya mutasi pada tanaman jeruk keprok Garut. Sel-sel kalus embriogenik yang telah diiradiasi dengan sinar gamma tersebut pada akhirnya, setelah diregenerasikan melalui proses embriogenesis somatik, dapat menghasilkan tanaman mutan harapan mutan putatif generasi MV1 yang solid. Individu tanaman mutan harapan tersebut merupakan mutan harapan yang solid, bukan kimera, karena satu tanaman berasal dari satu sel tunggal yang teriradiasi gamma. Perubahan yang terjadi pada genotipe tanaman akibat mutasi dapat menyebabkan perubahan fenotipesifat tanaman. Sifat-sifat tanaman tersebut selanjutnya dapat diseleksi sesuai dengan tujuan yang diinginkan. Perubahan-perubahan sifatkarakter individu-individu sampel uji yang mencerminkan perubahan secara genotipe, dapat dibuktikan baik secara morfologi maupun molekuler. Pembuktian secara molekuler dapat menggunakan penanda ISSR ataupun RAPD. Hasil analisis menggunakan penanda-penanda molekuler terhadap individu-individu sampel uji tersebut dikatakan berbeda apabila pola pita-pola pita yang dihasilkan adalah polimorfik. Dengan demikian, proses induksi mutasi dengan penerapan iradiasi gamma pada kalus embriogenik jeruk keprok SoE dengan dosis LD 50 75 Gy telah berhasil menyebabkan terjadinya