Ketahanan Tanaman Jeruk terhadap Penyakit Huanglongbing

20 3 INDUKSI KALUS EMBRIOGENIK DAN STUDI EMBRIOGENESIS SOMATIK JERUK KEPROK SOE ASAL NTT 1 Induction of Embryogenic Calli and Study of Somatic Embryogenesis of SoE Mandarine from East Nusa Tenggara Abstrak Kalus embriogenik KE, langsung ataupun tidak langsung, dapat diinduksi dari biji yang masih muda immature seed. Biji yang masih muda terdapat jaringan nuselus yang dapat digunakan sebagai eksplan awal dalam pembentukan embrio somatik ES. Kalus embriogenik dapat juga diinduksi dari biji yang sudah matang mature seed. Biji yang telah matang, jaringan nuselus telah mengalami degenerasi membentuk embrio nuselar Koltunow et al. 1995. Tujuan penelitian tahap ini adalah: 1 Memperoleh kalus embriogenik dari eksplan biji matang jeruk keprok SoE dengan penambahan kombinasi BAP dan 2.4-D; 2 Memperoleh embrio somatik jeruk keprok SoE melalui proses pendewasaan kalus embriogenik dengan penambahan ABA dan air kelapa; 3 Memperoleh planlet jeruk keprok SoE melalui proses perkecambahan embrio somatik dengan penambahan GA 3 dan air kelapa; dan 4 Mempelajari proses embriogenesis somatik jeruk keprok SoE. Percobaan induksi kalus embriogenik dan pembentukan embrio somatik awal menggunakan media MW dengan penambahan beberapa taraf konsentrasi 2.4-D yaitu 0, 0.1, 0.3 dan 0.5 mg L -1 dikombinasikan dengan 3 mg L -1 BAP. Proses proliferasi, sinkronisasi dan pendewasaan KE membentuk ES menggunakan ABA 0, 0.5, 1, 2 dan 4 mg L -1 dan air kelapa 0,5, 10, 15 dan 20. Perkecambahan embrio somatik menggunakan GA 3 0, 0.5, 1, 2 dan 4 mg L -1 dan air kelapa 0,5, 10, 15 dan 20. Hasil menunjukkan bahwa KE jeruk keprok SoE dapat diinduksi dengan menambahkan BAP sebanyak 3 mg L -1 ke dalam media MW tanpa perlu penambahan 2.4-D. Penambahan ABA hingga 0 – 4 mg L -1 tidak menunjukkan pengaruh yang nyata pada proses proliferasi dan sinkronisasi KE membentuk ES fase globular transisi. Penambahan air kelapa menunjukkan pengaruh yang nyata pada proses sinkronisasi KE membentuk ES fase globular transisi. Penambahan ABA 1 mg L -1 dapat meningkatkan pendewasaan embrio somatik sebesar 98.5 dari kontrol, sedangkan penambahan air kelapa belum dapat meningkatkan pendewasaan embrio somatik melebihi perlakuan kontrol. Penambahan GA 3 dan air kelapa tidak menunjukkan pengaruh pada perkecambahan embrio somatik membentuk kecambah. Embrio somatik terbentuk dari individu-individu sel kompeten yang mirip dengan zigot yang berturut-turut membentuk massa pro- embrio PEM, globular awal, globular akhir, embrio somatik fase hati, torpedo dan embrio somatik dewasa fase kotiledon. Kata kunci: bipolar, globular, in vitro, media 1 Sebagian isi Bab ini telah dipublikasikan dalam jurnal internasional “Horticultural Biotechnology Research” Vol. 1 tahun 2015. 21 Abstract Embryogenic callus, directly or indirectly, can usually be induced from seeds that are still young immature seed. At the young seeds are nucelus tissue that can be used as initial explants in the formation of somatic embryos. Embryogenic callus can also be induced from seeds that are old mature seed. Seeds that have been elderly, nucelus tissue have degenerated form a nucelar embryo. Koltunow et al. 1995. The research objective of this stage is: 1 Getting embryogenic callus from explants seeds old SoE mandarine with the addition of a combination of BAP and 2.4-D; 2 Getting somatic embryos SoE mandarine through a maturing process embryogenic callus with the addition of ABA and coconut water; 3 Getting SoE mandarine plantlets through somatic embryo germination process with the addition of GA 3 and coconut water; and 4 Study of the process of somatic embryogenesis SoE mandarine. Experiment of embryogenic callus induction and early somatic embryo formation used media MW with the addition of some level of 2.4-D concentrations were 0, 0.1, 0.3 and 0.5 mg L -1 combined with 3 mg L -1 BAP. Proliferation process, synchronization and maturation of embryogenic callus forming somatic embryos using ABA 0, 0.5, 1, 2 and 4 mg L -1 and coconut water 0, 5, 10, 15 and 20. The germination of somatic embryos using GA 3 0, 0.5, 1, 2 and 4 mg L -1 and coconut water 0.5, 10, 15 and 20. The results showed that the embryogenic callus of SoE mandarine formation can be induced by adding 3 mg L -1 BAP to the MW media without the addition of 2.4-D. The addition of ABA 0-4 mg L -1 did not show any significant effect on the proliferation and synchronization embryogenic callus forming somatic embryos transition globular phase. The addition of coconut water showed a marked influence on the synchronization process embryogenic callus forming globular somatic embryos phase transition. The addition of ABA 1 mg L - 1 can improve the maturation of somatic embryos amounted to 98.5 of control, whereas the addition of coconut water can not increase maturation of somatic embryos beyond the control treatment. The addition of GA 3 and coconut water showed no effect on the germination of somatic embryos formed sprouts. Keywords: bipolar, globular, in vitro, medium 22

3.1 Pendahuluan

Embriogenesis somatik adalah suatu prosedur di mana satu atau sekelompok sel berasal dari jaringan somatik membentuk suatu embrio. Embriogenesis somatik merupakan suatu prosedur sederhana untuk regenerasi tanaman yang efisien dan cepat Zhang et al. 2009. Embriogenesis somatik umumnya terjadi secara tidak langsung melalui fase pembentukan kalus atau secara langsung dari eksplan awal Han et al. 2011. Kalus embriogenik yang akan membentuk embrio somatik ES biasanya terinduksi dari biji buah yang belum matang immature seed Kepiro Roose 2007. Pada immature seed terdapat jaringan somatik diploid yaitu nuselus yang dapat diinduksi untuk menghasilkan embrio somatik yang memiliki sifat sama dengan induknya. Sejalan dengan berkembangnya ovule membentuk mature seed, nuselus terdegenerasi menjadi embrio nuselar. Dalam biji matang juga terdapat sel-sel sinergid dan antipodal yang dapat berkembang membentuk embrio Koltunow et al. 1995. Embrio nuselar, sel-sel sinergid dan antipodal dapat digunakan untuk perbanyakan tanaman dengan tujuan untuk mendapatkan tanaman yang sama secara genetik, true-to-type Khan et al. 2007. Embriogenesis somatik prosesnya mirip dengan embriogenesis zigotiknya, yaitu dimulai dari pembentukan pro-embrio, late-globular, kemudian bertumbuh membentuk embrio somatik fase jantung dan torpedo, hingga membentuk embrio somatik dewasa fase kotiledon, dan akhirnya kecambah. Asam Absisat ABA merupakan zat pengatur tumbuh ataupun inhibitor, berfungsi selain memperlambat pertumbuhan kultur, juga dapat mempertebal jaringan Mariska 2014. Dalam penelitian ini digunakan untuk memperlambat proliferasi kalus embriogenik sehingga dapat mendorong terbentuknya embrio somatik. Asam Giberelin GA 3 telah diketahui dapat merangsang perkecambahan dari biji yang telah matang untuk membentuk tunas atau tanaman kecil yang baru kecambah. Air kelapa ditambahkan pada media pendewasaan dan perkecambahan embrio somatik jeruk keprok SoE, karena air kelapa memiliki kandungan beberapa senyawa penting untuk pertumbuhan dan perkembangan sel dan jaringan tanaman. Air kelapa mengandung senyawa biokimia seperti potassium, sodium, kalsium, fosfor, besi, tembaga, sulfur, magnesium, asam askorbat dan grup vitamin B, asam-asam amino bebas yang terdiri dari glutamine, arginine, asparagine, alanine dan asam aspartate Gnasekaran et al. 2012; mengandung pengatur tumbuh alami auksin dan sitokinin yang dapat disubstitusikan dengan pengatur tumbuh sintetik dalam proses kultur jaringan tanaman Mandang 1993. Beberapa penelitian yang berkaitan dengan induksi pembentukan dan regenerasi ES telah dilakukan seperti pada jeruk Citrus limon L., embriogenesis somatik berhasil dilakukan baik embriogenesis langsung maupun tidak langsung, dengan media Murashige dan Skoog MS yang ditambahkan 500 mg L -1 ekstrak malt + 50 g L -1 sukrosa + 3 mg L -1 BA Gholami et al. 2013. Embriogenesis somatik dan regenerasi tanaman dari ovule yang tidak berkembang dari 10 jenis tanaman jeruk, dapat diinduksi menggunakan pengatur tumbuh seperti 6- benzylaminopurin BAP dengan konsentrasi 3 mg L -1 pada media MS yang dikombinasikan dengan 500 mg L -1 ekstrak malt dan 50 g L -1 sukrosa El-Sawy et al. 2006. Beberapa penelitian yang menggunakan ABA dan GA 3 untuk proses 23 pendewasaan dan perkecambahan embrio somatik yang diterapkan pada jeruk keprok Batu 55, jeruk Siam dan Keprok Garut Merigo 2011; Karyanti 2013; Wulansari 2013. Tujuan penelitian tahap ini adalah: 1 Memperoleh kalus embriogenik dari eksplan biji matang jeruk keprok SoE dengan penambahan kombinasi BAP dan 2.4-D; 2 Memperoleh embrio somatik jeruk keprok SoE melalui proses pendewasaan kalus embriogenik dengan penambahan ABA dan air kelapa; 3 Memperoleh planlet jeruk keprok SoE melalui proses perkecambahan embrio somatik dengan penambahan GA 3 dan air kelapa; dan 4 Mempelajari proses embriogenesis somatik jeruk keprok SoE. 3.2 Bahan dan Metode 3.2.1 Tempat dan Waktu Penelitian tahap ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan 1, Departemen Agronomi dan Hortikultura AGH, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor IPB. Pengamatan analisis secara mikroskopis dilaksanakan di Laboratorium Mikroteknik Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian IPB, Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan FKH. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Mei 2013 sampai April 2016.

3.2.2 Bahan dan Alat

Bahan tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah biji matang kupas mature seed jeruk keprok SoE. Buah jeruk SoE diperoleh dari Kecamatan SoE, Kabupaten Timur Tengah Selatan TTS, Propinsi Nusa Tenggara Timur NTT. Bahan media untuk kultur in vitro adalah media dasar Murashige and Skoog MS yang dimodifikasi dengan penambahan vitamin Morel and Weitmore MW Lampiran 2 yang disebut media MW Husni 2010, 2,4-Dichlorophenoxy acid 2.4-D, Benzilamino Purin BAP, Asam Absisat ABA, Asam Giberelin GA3, air kelapa AK, bahan pemadat media Phytagel Sigma. Otoklaf, Laminar Air Flow, timbangan digital, mikroskop cahaya.

3.2.3 Metode Percobaan

Penelitian pada Bab ini dilakukan dalam beberapa tahap kegiatan, yaitu: 1 Induksi kalus embriogenik; 2 Proliferasi dan Sinkronisasi kalus embriogenik membentuk late globular; 3 Pendewasaan pro-embrio membentuk embrio somatik fase kotiledon; 4 Perkecambahan embrio somatik dewasa membentuk planlet; 5 Pembesaran dan aklimatisasi planlet; dan 6 Studi embriogenesis somatik jeruk keprok SoE.

3.2.3.1 Percobaan 1. Induksi Kalus Embriogenik Jeruk Keprok SoE

Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media in vitro yang sesuai dengan penambahan BAP yang dikombinasikan dengan 2.4-D untuk induksi kalus embriogenik dari eksplan biji matang kupas mature seed jeruk keprok SoE. Percobaan dilaksanakan menggunakan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap RAL satu faktor dengan 4 perlakuan media induksi yang terdiri dari empat taraf 2.4-D 0, 0.1, 0.3 dan 0.5 mg L -1 yang 24 dikombinasikan dengan BAP 3 mg L -1 . Setiap perlakuan terdiri atas 4 ulangan, yang mana setiap ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan satu eksplan. Biji jeruk keprok SoE dicuci dengan deterjen dan dibilas dengan air bersih. Selanjutnya, biji jeruk disterilkan dengan larutan 50 bayclean 5 dalam Laminar Air Flow Cabinet, kemudian dibilas tiga kali dengan aquades steril. Setelah dibilas, biji diletakkan di atas kertas tisu steril untuk menyerap sisa-sisa air yang masih melekat pada biji. Kulit biji dikupas dengan menggunakan pinset dan skalpel. Biji yang telah dikupas kemudian diinokulasikan di atas media sesuai perlakuan. Kultur diinkubasikan pada suhu 25 o C dengan penyinaran lampu TL 20 W, periode 24 jam. Pengamatan dilakukan terhadap kalus embriogenik yang terbentuk pada setiap eksplan sesuai perlakuan, jumlah embrio somatik yang terbentuk pada setiap perlakuan, proses pembentukan ES fase globular transisi late globular, dan fase-fase pertumbuhan embrio somatik. Data pengamatan kalus embriogenik dihitung berdasarkan persentase. Data embrio somatik yang diperoleh dianalisis menggunakan software Statistical Tool for Agricultural Research STAR untuk analisis varian Anova. Hasil Anova yang berbeda nyata dilakukan analisis lanjut menggunakan Duncan Multiple Rate Test DMRT 5. Kalus embriogenik hasil dari Percobaan 1, diambil satu buah embrio transisi late globular dan dipindahkan ke media MW tanpa penambahan zat pengatur tumbuh untuk proliferasi kalus embriogenik dan embrio somatik true-to-type, optimasi proliferasi dan supaya terhindar dari habituasi BAP dan untuk digunakan pada tahap selanjutnya. 3.2.3.2 Percobaan 2 dan 3. Proliferasi dan Sinkronisasi Kalus Embriogenik Jeruk Keprok SoE Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media in vitro yang sesuai untuk proliferasi dan sinkronisasi kalus embriogenik KE membentuk late globular. Percobaan dilaksanakan menggunakan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap RAL satu faktor. Media perlakuan yang ditambahkan adalah ABA yang terdiri atas lima taraf 0, 0.5, 1, 2 dan 4 mg L -1 , dan media perlakuan yang ditambahkan air kelapa dengan lima taraf konsentrasi 0, 5, 10, 15 dan 20. Untuk proliferasi dan sinkronisasi KE membentuk late globular, setiap perlakuan terdiri atas 10 ulangan, yang mana setiap ulangan adalah satu botol sebagai satu unit percobaan dengan dua gumpalan KE. Setiap gumpalan KE yang diambil berukuran ±0.5 cm atau setara dengan rata-rata 300 mg dan diletakkan di atas media perlakuan. Pengamatan proliferasi dan sinkronisasi KE membentuk globular dilakukan terhadap diameter kalus embriogenik KE dan jumlah globular transisi late globular yang terbentuk pada 4 minggu setelah perlakuan MSPr. Data proliferasi dan sinkronisasi ES yang diperoleh dianalisis menggunakan software Statistical Tool for Agricultural Research STAR untuk analisis varian Anova. Hasil Anova yang berbeda nyata dilakukan analisis lanjut menggunakan Duncan Multiple Rate Test DMRT 5. 25 3.2.3.3 Percobaan 4. Pendewasaan Pro-embrio Early-Globular Membentuk Embrio Somatik Dewasa Fase Kotiledon Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media yang sesuai untuk proses pendewasaan pro embrio membentuk embrio somatik dewasa. Pendewasaan pro-embrio membentuk ES dewasa dilakukan dalam suatu rancangan percobaan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan 4 perlakuan, setiap perlakuan terdiri dari 3 ulangan, setiap ulangan adalah satu botol sebagai satu unit percobaan dengan 4 gumpalan KE. Untuk jumlah rata-rata massa pro- embrio PEM dan globular muda early globular diambil dari 3 titik gumpalan kecil KE. Gumpalan kecil KE diamati di bawah mikroskop terhadap PEM dan globular muda early globular, sehingga diperoleh jumlah rata-rata untuk PEM adalah 30 buah dan jumlah rata-rata globular muda adalah 3 buah. Setiap gumpalan kecil KE diletakkan di atas media MW yang ditambahkan ZPT-ABA dan air kelapa AK sesuai perlakuan. Pendewasaan KE membentuk ES dewasa pada setiap fase dihitung pada 6 minggu setelah perlakuan MSPr. Pendewasaan ES yang terbentuk dihitung berdasarkan persentase pembentukan pada setiap unit percobaan.

3.2.3.4 Percobaan 5 dan 6. Perkecambahan Embrio Somatik Jeruk Keprok SoE

Percobaan dilakukan untuk mendapatkan formulasi media in vitro yang sesuai untuk perkecambahan embrio somatik jeruk keprok SoE dengan menambahkan GA 3 dan air kelapa. Percobaan dilaksanakan menggunakan rancangan lingkungan rancangan acak lengkap RAL satu faktor. Media perlakuan yang ditambahkan GA 3 terdiri dari lima taraf 0, 0.5, 1, 2 dan 4 mg L -1 , dan media perlakuan yang ditambahkan air kelapa dengan lima taraf konsentrasi 0, 5, 10, 15 dan 20. Setiap perlakuan terdiri atas 10 ulangan, yang mana setiap ulangan adalah satu botol sebagai unit percobaan dengan dua embrio somatik matang. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah embrio somatik yang berkecambah. Data perkecambahan ES yang diperoleh dianalisis menggunakan software Statistical Tool for Agricultural Research STAR untuk analisis varian Anova. Hasil Anova yang berbeda nyata dilakukan analisis lanjut menggunakan Duncan Multiple Rate Test DMRT 5.

3.2.3.5 Pembesaran dan Aklimatisasi Planlet Jeruk Keprok SoE

Pembesaran planlet dilakukan dengan cara: kecambah yang masih memiliki dua daun pertama yang telah terbuka dipindahkan ke medium pembesaran planlet yaitu medium MW tanpa ada penambahan zat pengatur tumbuh MW0. Kecambahtunas disubkultur setiap bulan ke medium MW yang baru hingga empat kali selama empat bulan atau hingga terbentuk planlet yang telah memiliki empat atau lima daun yang telah terbuka. Planlet yang telah berumur 4 bulan atau telah memiliki daun sebanyak 4-5 buah daun, dikeluarkan dari dalam botol kultur dan dibersihkan dari sisa bahan pemadat Phytagel yang masih melekat. Planlet direndam dalam larutan yang mengandung fungisida dan bakterisida selama 20 menit. Media tanam untuk proses aklimatisasi planlet digunakan campuran tanah:kokofit:arang sekam dengan perbandingan 1:1:1. Media dimasukkan ke dalam gelas-gelas plastik. 26 Planlet kemudian ditanam pada media tersebut di atas dan ditutup rapat dengan plastik dan ditempatkan di bawah naungan paranet yang dapat mengurangi intensitas cahaya hingga 40.

3.2.3.6 Studi Embriogenesis Somatik Jeruk Keprok SoE

Massa pro-embrio PEM diambil dan diletakkan di atas kaca preparat. Preparat ditempatkan di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran lensa obyektif 40 kali dan difoto. Jaringan late globular dianalisis menggunakan metode pewarnaan hematoxylin dan eosin. Sampel jaringan tersebut difoto menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran lensa obyektif 4, 10 dan 40 kali. Embrio somatik jeruk keprok SoE diletakkan di atas petridish, dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 10-20 kali dan difoto. Untuk sampel yang berukuran lebih dari 0.5 cm dapat difoto secara langsung tanpa menggunakan mikroskop. Pengamatan dilakukan terhadap: fase-fase pertumbuhan massa pro-embrio PEMearly globular dan fase-fase pertumbuhan embrio somatik. 3.3 Hasil dan Pembahasan 3.3.1 Induksi Pembentukan Kalus Embriogenik Jeruk Keprok SoE Tabel 2 memperlihatkan persentase pembentukan kalus embriogenik KE dan hasil analisis varian pengaruh media perlakuan terhadap pembentukan embrio somatik ES. Media perlakuan induksi KE yang ditambahkan BAP dengan konsentrasi 3 mg L -1 tanpa penambahan 2.4-D menghasilkan persentase induksi KE paling tinggi dibandingkan dengan tiga perlakuan yang lain. KE dapat diamati pada umur kultur 13 minggu setelah tanam MST. Analisis varian pertumbuhan KE membentuk embrio somatik ES berbeda nyata pada umur 17 minggu setelah tanam MST dan sangat berbeda nyata pada umur 25 MST. Hasil uji jarak berganda Duncan DMRT taraf 5 memperlihatkan bahwa medium perlakuan 1 dengan penambahan BAP 3 mg L -1 menghasilkan ES lebih banyak. Medium perlakuan 1 BAP 3 mg L -1 berbeda nyata dengan medium perlakuan 3 BAP 3 mg L -1 +2.4-D 0.3 mg L -1 dan 4 BAP 3 mg L -1 +2.4-D 0.5 mg L -1 , baik pada minggu ke 17 maupun minggu ke 25, tapi tidak berbeda nyata dengan perlakuan 2 BAP 3 mg L -1 +2.4-D 0.1 mg L -1 . Pembentukan embrio somatik yang diawali dengan pembentukan kalus embriogenik untuk jeruk keprok SoE cukup menggunakan BAP 3 mg L -1 tanpa perlu menambahkan 2.4-D dalam media induksi. Media perlakuan BAP 3 mg L -1 yang dikombinasikan dengan 2,4-D taraf 0.1, 0.3 dan 0.5 mg L -1 , masing-masing memperlihatkan persentase induksi kalus embriogenik dan rata-rata jumlah embrio somatik yang semakin menurun dengan meningkatnya konsentrasi 2,4-D. Hal tersebut menunjukkan bahwa konsentrasi 2,4-D dari 0.1 - 0.5 mg L -1 yang dikombinasikan dengan 3 mg L -1 BAP dapat menginduksi terbentuknya kalus embriogenik tapi juga dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan kalus embriogenik dan embrio somatik lebih lanjut. Hasil penelitian ini mirip dengan hasil yang telah diperoleh Husni 2010, Husni et al. 2010, Husni et al. 2007, Carimi et al. 1999, Kosmiatin et al. 2014, Merigo 2011, El-Sawy et al. 2006, dan Gholami et al. 2013. 27 Gambar 3 Induksi kalus embriogenik dari biji matang mature seed jeruk keprok SoE. a kalus embriogenik, b sisa kulit biji seed coat, c tunas. Berdasarkan hal tersebut dapat dijelaskan bahwa embrio somatik yang diperoleh tersebut terbentuk melalui proses embriogenesis somatik tidak langsung indirect somatic embryogenesis. Struktur kalus yang dihasilkan berstruktur remah, tidak kompak, dan berwarna kuning mengkilap. Pembentukan embrio somatik yang diawali dengan terbentuknya kalus embriogenik yang terbentuk dari eksplan biji Gambar 3. Respon eksplan terhadap media nampak bahwa KE dan ES jenis globular muda terlihat pada belahan kotiledon biji bagian dalam biji matang mature seed jeruk keprok SoE yang dikulturkan. Kalus embriogenik dan globular muda tersebut diduga berasal dari proliferasi embrio nuselar yang terbentuk dari jaringan nuselar setelah biji berkembang menjadi matang. Seperti yang dijelaskan oleh Koltunow et al. 1995 bahwa embrio nuselar terbentuk dari nuselus yang terdegenerasi. Kalus embriogenik tersebut bila dilihat di bawah mikroskop terdiri dari massa pro-embrio PEM dan bulatan-bulatan kecil yang disebut globular muda early globular Gambar 4. Tabel 2 Persentase pembentukan kalus embriogenik KE dan analisis varian dan uji lanjut DMRT rata-rata jumlah embrio somatik ES yang terbentuk pada media perlakuan induksi kalus embriogenik jeruk keprok SoE. No Media Perlakuan Persentase Pembentukan Kalus KE Rata-rata Jumlah Embrio Somatik ES …..………. Minggu ke ….…………… 13 17 25 1. 2. 3. 4. BAP 3 mgL BAP 3 mg L -1 +2.4-D 0.1 mg L -1 BAP 3 mg L -1 +2.4-D 0.3 mg L -1 BAP 3 mg L -1 +2.4-D 0.5 mg L -1 100 75 25 8.00 a 3.75 ab 0.75 b 0.25 b 20.00 a 5.75 ab 4.00 b 0.75 c F value 5.84 8.35 : nyata pada taraf 5, tn tidak nyata, angka yang diikuti dengan huruf yang sama tidak berbeda nyata pada analisis DMRT taraf 5. Penggunaan BAP tunggal diketahui efektif dalam induksi kalus embriogenik dan embrio somatik serta multiplikasi tunas seperti yang telah dilakukan oleh Husni et al. 2010, Wulansari et al. 2012, Karyanti et al. 2015 dan Merigo 2011. Penelitian untuk mendapatkan ES juga dilakukan oleh El- Sawy et al. 2006 menggunakan eksplan ovule dari biji muda sepuluh macam jeruk dan Gholami et al. 2013 menggunakan eksplan biji muda C. limon L..