Penanda RAPD OPA03, OPE14 dan OPN14

60

5.1 Pendahuluan

Penyakit Huanglongbing atau pucuk menguning adalah salah satu dari tujuh penyakit penting yang menyerang tanaman jeruk. Penyakit ini sering disebut juga Citrus Vein Phloem Degeneration CVPD Sutopo 2013. Penyakit ini disebabkan oleh sejenis bakteri gram negatif yang disebut Candidatus Liberibacter asiaticus Jepson 2009. Bakteri ini belum dapat dikulturkan secara in vitro. Bakteri ini hidup dan berkembang biak serta memperoleh nutrisi dalam berkas pembuluh angkut floem tanaman. Bakteri penyebab penyakit ini dapat berpindah dari jeruk yang sakit ke jeruk yang sehat dengan beberapa cara, salah satunya melalui vektor serangga Diaphorina citri Aubert 1987; Wijaya et al. 2010. Serangga ini mengambil makanannya dari tanaman inangnya dengan cara menusuk dan mengisap sari makanan dari berkas pembuluh floem yang ada pada tulang daun tanaman jeruk. Apabila serangga ini berpindah ke tanaman jeruk yang sehat maka serangga ini dapat menularkan bakteri penyebab penyakit Huanglongbing Jepson 2009. Pengendalian penyakit Huanglongbing pada tanaman jeruk akan lebih baik dilakukan bila diketahui keberadaannya sejak dini dengan melakukan deteksi awal menggunakan teknik PCR; menggunakan tanaman jeruk yang tahan terhadap penyakit De Lange et al. 1985 atau bebas patogen Widyaningsih et al. 2013. Deteksi awal penyakit ini diharapkan dapat mengatasi meluasnya penyebaran penyakit ini. Tanaman jeruk yang telah terjangkit penyakit Huanglongbing menunjukkan gejala eksternal yang mirip dengan tanaman yang kekurangan unsur hara yaitu daunnya menguning. Namun gejala tersebut akan nampak setelah beberapa bulan sejak tanaman terjangkit penyakit ini, sehingga upaya untuk mengatasi penyakit ini menjadi terlambat. Selain melihat gejala eksternal yang muncul, teknik yang lain juga dapat digunakan untuk mengetahui dan mendeteksi apakah suatu tanaman jeruk telah terjangkit penyakit Huanglongbing atau belum, seperti dengan melihat gejala internal dengan pengujian akumulasi pati dengan larutan iodine Wirawan et al. 2004, analisis mikroskopis histopatologi Aubert 2008, dan deteksi menggunakan teknik PCR dengan penanda spesifik OI1 dan OI2c Jagoueix et al. 1996. Setiap jenis analisis memiliki kelebihan dan kekurangannya masing-masing. Deteksi dengan teknik PCR dapat digunakan pada tanaman yang masih berumur muda, tidak memperlihatkan gejala penyakit, tidak membutuhkan waktu yang lama, dan hanya membutuhkan bahan sampel yang sedikit, walaupun membutuhkan biaya yang lebih mahal. Sedangkan deteksi dengan melihat gejala eksternal dan gejala internal dengan uji pati-iodine dan histopatologi walaupun hanya membutuhkan biaya alat dan bahan yang tidak terlalu mahal, tapi sangat sulit digunakan untuk deteksi penyakit secara dini. Tujuan penelitian tahap ini adalah: 1 Mengevaluasi ketahanan individu- individu mutan harapan jeruk keprok SoE terhadap penyakit Huanglongbing; 2 Memperoleh individu-individu mutan harapan tahan terhadap penyakit Huanglongbing. 61 5.2 Bahan dan Metode 5.2.1 Tempat dan Waktu Kegiatan akuisisi vektor penyakit dilakukan di kebun jeruk milik petani Kelurahan Situ Gede, Kecamatan Bogor Barat, Kota Bogor. Infestasi penyakit Huanglongbing dilakukan di Desa Ciherang, Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor, Provinsi Jawa Barat. Deteksi ada tidaknya penyakit Huanglongbing dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Departemen Proteksi Tanaman PTN dan Laboratorium Mikro Teknik Departemen Agronomi dan Hortikultura AGH Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor IPB. Penelitian dilaksanakan sejak bulan Maret sampai Desember 2015.

5.2.2 Bahan dan Alat

Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah individu- individu mutan harapan, tanaman jeruk kip positif bergejala Huanglongbing sebagai kontrol positif dan dua jeruk kingkit Triphasia trifolia sebagai jeruk pembanding yang tahan terhadap penyakit. PCR ready mix DreamTaq Green, primer forwardreverse OI1OI2c, buffer Phytoplasma Grinding buffer PGB Lampiran 7, Tabel 13 - Tabel 15, bufer lisis CTAB, TAE 1X, TAE 2X, TE 1X. Alat yang digunakan adalah mikropipet, mikrotip, sentrifus Mikro 200R Hettich Zentrifugen, thermal cycler GeneAMP PCR System 9700, waterbath, apparatus elektroforesis, UV transiluminator. 5.2.3 Metode Penelitian 5.2.3.1 Penyiapan Sumber Inokulum dan Vektor Periode akuisisi dilakukan selama satu minggu untuk serangga vektor penyakit Huanglongbing, Diaphorina citri, dengan mengurung serangga tersebut pada tanaman jeruk yang telah diketahui positif dengan deteksi PCR mengandung penyebab penyakit Huanglongbing. Setelah akuisisi, selanjutnya dilakukan infestasi serangga vektor ke tanaman individual sampel uji jeruk keprok SoE yang diberi sungkup terbuat dari plastik transparan dan kain kasa. Setiap tanaman sampel uji diberi tiga ekor serangga vektor untuk inokulasi patogen.

5.2.3.2 Pengamatan Gejala Eksternal Penyakit Huanglongbing

Pengamatan gejala eksternal penyakit Huanglongbing dilakukan pada awal hingga akhir pengujian selama tiga bulan. Gejala diamati pada daun individu- individu kontrol dan mutan harapan 0c, 75a, 75c, 75g, 75h, jeruk kingkit sebagai kontrol negatif dan dibandingkan dengan kontrol positif. Daun yang dijadikan sebagai kontrol positif adalah daun yang memiliki gejala eksternal penyakit Huanglongbing, diambil dari tanaman jeruk yang ada di kebun jeruk milik petani di Desa Situ Gede, Kecamatan Bogor Barat, Kota Bogor yang telah diketahui positif terjangkit penyakit Huanglongbing dengan melihat gejala dan deteksi PCR.

5.2.3.3 Pengamatan Gejala Internal melalui Pengujian Akumulasi Pati

Pengamatan gejala internal dengan pengujian akumulasi pati dilakukan 6 bulan setelah dilakukannya infestasi serangga vektor penyakit Huanglongbing. Tulang daun dari daun jeruk bergejala penyakit Huanglongbing kontrol positif 62 dan tulang daun jeruk kingkit sebagai kontrol negatif, serta individu-individu sampel uji 0c, 75a, 75b, 75c, 75g, 75h, didiamkan selama semalam dalam lemari es. Daun kemudian direndam dengan ethanol 70 dan dipanaskan selama 1 jam. Daun dibiarkan pada suhu ruangan selama satu minggu hingga semua klorofilnya hilang. Bagian tulang daun diiris tipis, direndam dalam larutan iodine selama 15 menit dan dibilas dengan aquades. Sisa aquades diserap dengan kertas tisu. Tulang daun bagian pangkal daun diiris melintang dan diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 40 kali.

5.2.3.4 Pengamatan

Gejala Internal secara Histopatologi melalui Pengamatan Mikroskopis Pengamatan gejala internal dengan analisis mikroskopis histopatologi dilakukan 9 bulan setelah infestasi penyakit. Sampel-sampel yang dianalisis terdiri dari: individu mutan harapan nomor 75g hanya satu dari dua individubibit yang tersisa hidup, sampel kontrol positif dari Kebun Jeruk Desa Setu Gede dan kontrol negatif jeruk kingkit. Daun sampel diambil dan dibiarkan semalam dalam lemari es. Tulang daun bagian pangkal diiris melintang. Irisan tulang daun diletakkan di atas kaca preparat dan diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 40 kali. 5.2.3.5 Deteksi Penyakit Huanglongbing dengan Teknik PCR Menggunakan Penanda Spesifik Oi1 dan OI2c. Deteksi ada tidaknya penyakit Huanglongbing menular ke individu-individu sampel tanaman uji jeruk keprok SoE 0c, 75a, 75b, 75c, 75g,75h, 75k maupun pada tanaman kontrol negatif, dilakukan menggunakan teknik PCR dengan penanda spesifik OI1OI2c. Deteksi dilakukan 3 bulan 2 minggu setelah infestasi penyakit. Metode isolasi DNA total yang dipakai adalah metode Dellaporta et al. 1983 yang dimodifikasi. Ekstraksi DNA Bakteri dengan Metode Dellaporta yang dimodifikasi. Tulang daun seberat 0.005-0,100 gram, direndam dalam 1.5 mL campuran buffer ekstraksi Phytoplasma Grinding Buffer PGB, Asam Askorbat AA dan Bovine Serum Albumin BSAdingin dalam mortar dingin selama 15 menit agar terjadi plasmolisis. Gerus menggunakan pistil. Hasil gerusan disentrifugasi selama 5 menit kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 o C. Supernatan dipindahkan ke tabung mikro baru dan sentrifugasi 25 menit, 12000 rpm, 4 o C. Supernatan dibuang dan p elet diresuspensi dengan 750 µL buffer CTAB yang ditambah dengan 0.2 β- Mercaptoeteanol dan divorteks hingga tercampur rata. Suspensi diinkubasi pada suhu 65 o C selama 60 menit. Selama inkubasi, tabung berisi suspensi dibolak- balik setiap 10 menit. Suspensi kemudian dibiarkan di suhu ruangan selama 10 menit untuk menghilangkan panas. Buffer CIA Chloroform : isoamilalkohol 24:1 vv ditambahkan sebanyak 1000 µL. Suspensi dibolak-balik selama 10-15 menit, kemudian disentrifugasi 10 menit, 12000 rpm, 4 o C. Hasil sentrifugasi membentuk 3 lapisan. Suspensi DNA pada lapisan epifase paling atas diambil sebanyak 600 µL dan dipindahkan ke tabung mikro ukuran 2 mL. Etanol absolut dingin ditambahkan sebanyak 2x volume untuk presipitasi DNA. Campuran diinkubasi pada suhu -20 o C selama 15-18 jam overnight. Campuran kemudian disentrifugasi 15 menit, 12000 rpm, 4 o C. Supernatan dibuang dan pelet dicuci