41
4.1 Pendahuluan
Teknologi iradiasi secara luas digunakan untuk menghasilkan perubahan- perubahan dalam karakteristik yang mengarah pada pengembangan produk-
produk baru, karena iradiasi menyebabkan perubahan morfologi, struktural dan fungsional pada tanaman yang disebabkan oleh intensitas dan lamanya iradiasi
sinar gamma Piri et al. 2011. Iradiasi gamma dipilih karena memiliki daya tembus yang lebih tinggi dan homogen sehingga peluang terjadinya mutasi akan
lebih besar pula. Jeruk keprok SoE diiradiasi dengan sinar gamma pada tahap kalus embriogenik untuk menginduksi terjadinya perubahan genetik atau mutasi
pada setiap individu sel. Mutan harapan yang diperoleh dari hasil embriogenesis somatik merupakan mutan harapan yang solid, bukan kimera, karena berasal dari
satu sel tunggal Mba et al. 2009.
Dosis iradiasi sinar gamma yang digunakan mengambil standar lethal dose 50 LD50 dari hasil penelitian Karyanti 2013 yaitu 75.31 Gy yang dibulatkan
menjadi 75 Gy, dan dua dosis tambahan 65 dan 85 Gy. Sel-sel kalus embriogenik yang telah diiradiasi tersebut kemudian diregenerasikan secara in vitro melalui
proses embriogenesis somatik, dengan harapan diperoleh banyak individu planlet dengan sifat yang lebih beragam berdasarkan genotipe.
Keragaman genetik individu sampel mutan harapan mutan putatif dievaluasi menggunakan penanda molekuler inter simple sequen repeated ISSR
dan random amplified polimorphic DNA RAPD. ISSR dan RAPD adalah metode perbanyakan sintetis berbasis PCR yang mudah digunakan, penanda DNA
yang paling banyak digunakan untuk mengkarakter genetik berbagai tanaman, terdiri dari 10 basa sekuen arbitrary, dan mengandung paling sedikit 60 GC,
memungkinkan analisis DNA dilakukan dengan cepat, mudah dan tidak memerlukan informasi awal sekuen Agisimanto et al. 2007; Agisimanto
Supriyanto 2007; Yulianti et al. 2010. Evaluasi dengan RAPD memungkinkan untuk analisis benih tunggal dan bibit muda Saha et al. 2008, karena dalam
penelitian ini, analisis molekuler untuk melihat keragaman genetik diterapkan pada sampel uji yang masih sangat muda hasil aklimatisasi. Analisis ISSR dan
RAPD dapat meningkatkan efisiensi pada tahap awal seleksi, dapat memperpendek waktu yang diperlukan untuk program pemuliaan tanaman jeruk
Karsinah et al. 2002, dan dimanfaatkan untuk mengetahui keterpautan genetik antara beberapa jenis jeruk Gulsen et al. 2010.
Beberapa penelitian yang telah dilakukan menggunakan penanda ISSR dan RAPD pada tanaman jeruk seperti: Identifikasi variasi genetik jeruk keprok SoE
hasil iradiasi gamma oleh Yulianti et al. 2010; Identifikasi hubungan kekerabatan genetik pada jeruk Siam Indonesia menggunakan penanda RAPD.
Primer-primer RAPD mampu mendeteksi dan mengamplifikasi sekuen jeruk siam di dalam genom dengan jumlah yang beragam, baik di antara tipe primer maupun
dalam 1 jenis primer dan dapat memperlihatkan perbedaan susunan genetik antara individu yang berbeda yang ditunjukkan dengan adanya pita-pita hasil
elektroforesis yang polimorfik Agisimanto et al. 2007; Identifikasi hubungan genetik antara kultivar komersial jeruk lemon Citrus lemon Capparelli et al.
2004; analisis keragaman genetik jeruk Pamelo Indonesia juga telah dideteksi dengan RAPD Agisimanto Supriyanto 2007; Karsinah et al. 2002
42
Gambar 12 Satu embrio somatik a sumber kalus embriogenik b jeruk keprok SoE.
melakukan penelitian untuk mengetahui keragaman genetik plasma nutfah jeruk dan mengidentifikai kultivar jeruk berdasarkan penanda RAPD.
Evaluasi keragaman genetik dengan penanda ISSR dan RAPD ini diharapkan dapat menunjukkan hasil pola pita-pola pita DNA yang polimorfik
dari individu-individu sampel yang diuji. Pola pita-pola pita DNA yang polimorfik menunjukkan bahwa individu-individu sampel yang diuji beragam
sifatnya berdasarkan genotipe.
Tujuan penelitian tahap ini adalah 1 Meningkatkan keragaman genetik jeruk keprok SoE dengan sinar gamma; 2 Memperoleh individu mutan harapan
jeruk keprok SoE.
4.2 Bahan dan Metode 4.2.1 Tempat dan Waktu
Iradiasi gamma pada kalus embriogenik dilaksanakan di Pusat Tenaga Atom Nasional Patir-BATAN, Pasar Jumat, Jakarta Selatan. Proses kultur in vitro
bahan hasil iradiasi dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan 1, Departemen Agronomi dan Hortikultura AGH, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor
IPB. Isolasi DNA, proses PCR dan elektroforesis untuk analisis keragaman genetik tanaman dilaksanakan di Laboratorium Bakteriologi Departemen Proteksi
Tanaman PTN, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor IPB. Proses pengujian kualitas dan kuantitas DNA total dilakukan di IPBCC, IPB. Penelitian
tahap ini dilaksanakan dari bulan Maret 2014 sampai Oktober 2015.
4.2.2 Bahan dan Alat
Bahan yang dipakai untuk diiradiasi gamma adalah kalus embriogenik jeruk keprok SoE. Kalus embriogenik tersebut diperoleh dari hasil proliferasi satu
embrio somatik, sehingga diperoleh kalus embriogenik dengan genotipe yang sama Gambar 12.
Buffer-buffer isolasi DNA [Cetyl trimethyl ammonium bromide CTAB 2, Kloroform-isoamilalkohol CIA, 24:1, propan-2-ol isopropanol, etanol
70], agarose Invitrogen, TAE 1x, TAE 2x, loading dye, GelRed, Kappa 2G Fast PCR mix Lampiran 7, Primer RAPD dan ISSR Lampiran 3.
43 Alat yang digunakan adalah mikropipet, mikrotip, sentrifus Mikro 200R
Hettich Zentrifugen, thermal cycler GeneAMP PCR System 9700, waterbath, apparatus elektroforesis, UV transiluminator, Nanodrop 2000 Thermo Scientific.
4.2.3 Metode Penelitian 4.2.3.1 Iradiasi sinar gamma pada Kalus Embriogenik Jeruk Keprok SoE
Kalus embriogenik yang diperoleh dari tahap sebelumnya diiradiasi dengan sinar gamma yang berasal dari Gamma Chamber Iradiation dengan dosis
LD
50
, yaitu 75 Gy dan dua dosis tambahan, 65 dan 85 Gy. Setelah dilakukan iradiasi gamma terhadap sampel-sampel tersebut, sampel-sampel segera
disubkultur pada media MW yang baru. Individu-individu planlet yang dihasilkan dari hasil pertama iradiasi gamma selanjutnya disebut mutan harapan MV1
mutan putatif.
4.2.3.2 Percobaan 7. Induksi Mutasi dengan Sinar Gamma
Percobaan induksi mutasi dilakukan dalam Rancangan Lingkungan Rancangan Acak Lengkap. Percobaan terdiri atas 4 perlakuan dosis iradiasi sinar
gamma 0, 65, 75 dan 85 Gy yang diulang sebanyak 10 ulangan, satu ulangan terdiri atas satu botol kultur sebagai satu unit pengamatan, satu botol kultur terdiri
atas dua gumpalan kalus.
Pengamatan dilakukan terhadap perubahan warna yang terjadi pada inokulan kalus embriogenik, struktur kalus, serta bagus atau tidaknya
pertumbuhan. Waktu pengamatan 4 dan 8 minggu setelah iradiasi MSI. Data yang diperoleh diolah menggunakan Curva Expert32 dan dianalisa secara
deskriptif.
4.2.3.3 Analisis Keragaman Genetik Berdasarka n Morfologi
Pengamatan terhadap karakter-karakter morfologi dilakukan terhadap karakter-karakter kualitatif dan kuantitatif: Karakter kualitatif yang diamati adalah
bentuk dan warna batang, perlekatan helai daun, bentuk helai daun, warna daun dan bentuk pinggiran helai daun, ketegakan tunas. Karakter kuantitatif yang
diamati adalah tinggi planlet kontrol dan mutan harapan, jumlah daun, jumlah cabang, jumlah akar, jumlah stomata, panjang dan lebar stomata. Pengamatan
terhadap bentuk, warna dan tepi daun dilakukan berdasarkan deskripsi yang dikeluarkan oleh IPGRI 1999.
Karakter kualitatif diamati pada sampel-sampel yang diambil secara acak berupa individu-individu planlet kontrol R0 lima individu planlet dan mutan
harapan generasi MV1 hasil iradiasi gamma 65, 75 dan 85 Gy masing-masing lima individu planlet.
Karakter kuantitatif dilakukan melalui pengamatan tinggi planlet, jumlah daun, jumlah cabang dan jumlah akar. Sampel yang diamati diambil dari individu-
individu yang sama dengan pengamatan pada karakter kualitatif, yaitu sebanyak 5 individu planlet dari setiap perlakuan dosis iradiasi. Pengamatan karakter
kuantitatif seperti jumlah kerapatan stomata, panjang dan lebar stomata diamati pada sampel berupa individu-individu planlet kontrol R0 dan mutan harapan
generasi MV1 dari setiap perlakuan dosis iradiasi gamma 65, 75 dan 85 Gy. Setiap jenis mutan harapan diambil 1 individu, setiap individu diambil 3 daun
44 masing-masing 1 daun di bagian atas, 1 daun di bagian tengah dan 1 daun di
bagian bawah. Skoring penanda morfologi dilakukan terhadap beberapa karakter morfologi
yang pengamatannya diasumsikan setara dengan jenis primer pada penanda molekuler. Sub karakter setara dengan lokus pita pada penanda molekuler. Data
karakter morfologi tersebut diubah menjadi data biner dengan skoring 1 atau 0. Apabila karakter morfologi tidak dimiliki oleh planlet maka diberi nilai skor 0,
sedangkan apabila planlet memiliki karakter yang diamati maka diberikan nilai skor 1. Analisis stomata menggunakan metode analisis stomata sediaan preparat
segar menurut Mulyono 2011.
4.2.3.4 Analisis Keragaman Genetik Berdasarka n Penanda Molekuler
Untuk analisis keragaman dengan penanda molekuler ISSR dan RAPD, isolasi DNA sampel daun diambil dari individu-individu kontrol dan mutan
harapan yang masih berupa bibit yang telah berhasil diaklimatisasi. Limabelas sampel diambil secara acak, yang mewakili empat dosis iradiasi gamma lima
individu tanpa iradiasi kontrol dan sepuluh mutan harapan MV1 putatif, ditambah dengan satu jenis jeruk pembanding yaitu jeruk kingkit, sehingga total
individu yang dianalisis ada 16 sampel.
Isolasi DNA Total. DNA total dari 16 daun individu sampel uji seperti tersebut di atas diisolasi menggunakan Metode CTAB yang dimodifikasi Ardiana
2009 dengan penambahan β-Mercaptoetanol 0.2. Sampel daun ditimbang
sebanyak 1.0-10 mg 0.001 – 0.01 gram. Sampel digerus sampai halus bersama
buffer CTAB 750 µL menggunakan mortar dan pistil. Setelah halus, suspensi sampel dimasukkan dalam tabung mikro ukuran 2 ml dan diinkubasi dalam
waterbath dengan suhu 65
o
C selama 1 jam, tabung mikro dibolak-balik setiap 10 menit. Suspensi kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit dan
ditambahkan Kloroform-Isoamilalkohol CIA 24:1 sebanyak 750 µL. Suspensi disentrifus pada suhu 4
o
C, kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Lapisan epifase supernatan bagian atas campuran yang telah berpisah, diambil sebanyak
700 µL dan dipindahkan ke tabung mikro ukuran 1,5 mL yang baru. Propan-2-ol isopropanol ditambahkan sebanyak satu kali volume epifase yang diambil tadi
dan dibolak-balik perlahan selama 10 menit. Suspensi diinkubasi dalam lemari es suhu -20
o
C selama 10 - 20 menit dan disentrifuse pada suhu 4
o
C, kecepatan 12000 rpm selama 10 menit. Setelah suspensi disentrifus, buang supernatan, dan
pelet DNA berada pada dasar tabung mikro. Pelet DNA dicuci dua kali dengan menambahkan 200 µL etanol 70, lalu disentrifuse pada suhu 4
o
C, kecepatan 12000 rpm selama 5 menit, dan supernatan dibuang. Pelet kemudian
dikeringanginkan selama 1 jam pada suhu ruangan dengan memiringkan tabung mikro di atas lembaran tisu. Pelet yang telah kering diresuspensi dengan TE 1x
sebanyak 100 µl dan disimpan pada suhu -20
o
C. DNA total yang telah diperoleh dari proses ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan pengujian terhadap kualitas
maupun kuantitas DNA dengan menggunakan alat Nanodrop yang ada di IPBCC- IPB.
Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR. Amplifikasi DNA template dengan teknik Polimerase Chain Reaction PCR menggunakan mesin Thermal Cycler
AB9700. Satu campuran reaksi PCR total 25 µL dimasukkan dalam tabung PCR mikro 200 µL terdiri dari 12,5 µL PCR ready mix Kappa Biosystems dari
45 Genetika Science, 2 µL salah satu macam primer RAPD atau ISSR, aquabides
8.5 µL dan 2 µL DNA template. Kondisi PCR proses amplifikasi dari 16 sampel yang diuji dengan penanda
ISSR dan RAPD adalah sebagai berikut: Sampel-sampel dengan primer ISSR, proses amplifikasi terdiri dari: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95
o
C selama 3 menit, dilanjutkan dengan 40 siklus yang terdiri dari proses denaturasi suhu 95
o
C, selama 15 detik; annealing pada suhu 53
o
C, selama 15 detik; dan elongasi pada suhu 72
o
C, selama 2 detik, dan satu siklus pemanjangan akhir pada suhu 72
o
C selama 10 menit.
Sampel-sampel dengan primer RAPD, proses amplifikasi terdiri dari: satu siklus denaturasi awal pada suhu 95
o
C selama 3 menit, dilanjutkan dengan 40 siklus yang terdiri dari proses denaturasi pada suhu 95
o
C, selama 15 detik; annealing pada suhu 45
o
C, selama 15 detik, dan elongasi 72
o
C, selama 2 detik, dan satu siklus pemanjangan akhir 72
o
C selama 10 menit. Elektroforesis, Visualisasi dan Dokumentasi Pita DNA Hasil PCR. Sampel-
sampel hasil PCR, baik hasil amplifikasi dari primer ISSR maupun RAPD, masing-masing dilakukan pemisahan pita-pita DNA dengan secara elektroforesis
pada gel agarose konsentrasi 1,5 yang telah dicampur dengan GelRed untuk pewarnaan DNA dengan kekuatan arus listrik 75 Volt selama 30 menit untuk
sampel hasil amplifikasi dengan penanda ISSR dan 35 menit untuk sampel hasil amplifikasi dengan penanda RAPD. Setelah itu, gel hasil elektroforesis diletakkan
di atas UV transiluminator dan difoto untuk dokumentasi dengan kamera digital.
Skoring Penanda Molekuler. Pengamatan pada identifikasi molekuler dengan penanda RAPD dan ISSR dilakukan terhadap pola pita hasil pemisahan
dengan elektroforesis dari 16 sampel uji. Skoring pita DNA dilakukan berdasarkan keberadaan pita DNA pada setiap sampel tanaman. Pita-pita DNA
yang terbentuk dari hasil analisis penanda molekuler dianggap sebagai satu karakter yang mewakili satu lokus DNA. Pengamatan ditujukan pada pola pita
dengan jarak migrasi yang sama. Pita-pita DNA dengan laju migrasi yang sama diasumsikan sebagai lokus yang homolog. Apabila pada jarak migrasi yang sama
tidak terdapat pita, maka diberikan nilai skor 0. Sebaliknya, apabila pada jarak migrasi tersebut terdapat pita, maka diberikan nilai skor 1.
4.2.3.5 Analisis Data Hasil Skoring Penanda Morfologi dan Molekuler
Data hasil skoring morfologi dan molekuler dianalisis dengan program Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System NTSYSpc versi 2.00.
Koefisien kemiripan berdasarkan karakterisasi morfologi, molekuler dan data gabungan dianalisis berdasarkan Similarity for Qualitative Data SIMQUAL
program NTSYSpc versi 2.00. Tingkat kemiripan dihitung menggunakan koefisien Dice. Analisis pengelompokkan digunakan Sequential Agglomerative
Herarchical and Nested SAHN
– Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Average UPGMA yang disajikan dalam bentuk dendrogram.
Jarak genetik dihitung berdasarkan rumus Koefisien Dice Bustamam Mahrup 2003. Rumus koefisien Dice untuk menghitung jarak genetik: D = 1
– S. S: Similarity kemiripan.
46
4.3 Hasil dan Pembahasan 4.3.1 Respons Kultur Jeruk Keprok SoE Akibat Iradiasi Gamma
Induksi mutasi untuk meningkatkan keragaman genetik yang diterapkan pada kalus embriogenik menggunakan sinar gamma dosis 0, 65, 75 dan 85 Gy
menghasilkan perubahan-perubahan sifat morfologi yang dapat diamati pada individu kontrol R0 dan mutan harapan generasi MV1 R65, R75 dan R85,
seperti perubahan warna, struktur dan perkembangan kalus embriogenik, jumlah planlet normal dan abnormal, serta bentuk daun.
4.3.1.1 Warna, Struktur dan Perkembangan Kalus Embriogenik
Perubahan warna kalus embriogenik sebelum dan setelah diiradiasi dengan sinar gamma 4 dan 8 minggu setelah iradiasi dapat dilihat pada Tabel 6 dan
Gambar 13. Kalus embriogenik sebelum diiradiasi dengan sinar gamma, strukturnya remah dan berwarna kuning mengkilap. Setelah dilakukan iradiasi,
kalus umur 4 minggu setelah iradiasi MSI, pada dosis 65 Gy, struktur kalus nampak remah, sedikit berkembang dan berwarna kuning pucat. Pada dosis 75 Gy,
kalus nampak remah, perkembangannya bagus dan berwarna kuning keputihan, dan pada dosis 85 Gy, kalus nampak remah tapi tidak berkembang dan berwarna
kuning tua. Kalus embriogenik yang tidak diiradiasi, pada 4 MSI, strukturnya tetap remah dan berwarna kuning tapi tidak mengkilap.
Pada 8 MSI, dosis 65 Gy, struktur kalus masih remah dan berwarna kuning pucat. Pada dosis 75 Gy, struktur kalus remah dan berwarna kuning keputihan.
Dosis 85 Gy, struktur kalus masih remah, tidak berkembang dan berwarna kecoklatan agak hitam. Kalus embriogenik yang telah menghitam, tidak terjadi
pertumbuhan dan perkembangan sama sekali. Struktur dan warna kalus yang tidak diiradiasi, bila dibandingkan dengan struktur dan warna kalus yang telah diiradiasi,
adalah masih remah dan tetap berwarna kuning.
Tabel 6 Perubahan struktur dan warna kalus embriogenik jeruk keprok SoE sebelum dan setelah iradiasi dengan sinar gamma 4 dan 8 minggu
setelah iradiasi.
Waktu Objek
Dosis Iradiasi R0
R65 R75
R85 Sebelum
diiradiasi Struktur
Remah Remah
Remah Remah
Warna Kuning
mengkilap Kuning
mengkilap Kuning
mengkilap Kuning
mengkilap 4 minggu
setelah iradiasi
Struktur Remah
Remah, sedikit
berkembang Remah,
bagus berkembang
Remah, tidak
berkembang Warna
Kuning Kuning
pucat Kuning
putih Kuning tua
8 minggu setelah
iradiasi Struktur
Remah Remah
Remah Remah
Warna Kuning
Kuning pucat
Kuning putih
Coklat kehitaman