Alat dan Bahan Uji Bakteri E. coli Cara Pengambilan Sampel Untuk Zat Pewarna Alat dan Bahan Uji Zat Pewarna

3.4.2 Data sekunder

Data sekunder diperoleh dari studi kepustakan dan pengumpulan informasi berupa data-data seperti jurnal penelitian sebelumnya yang relevan dengan penelitian ini. 3.5 Pelaksanaan Penelitian 3.5.1 Cara Pengambilan Sampel Untuk E. coli 1. Persiapkan segala sesuatu untuk pengambilan sampel yaitu: a. Alat tulis b. Formulir pemeriksaan tentang lokasi pengambilan sampel dan tanggal pengambilan dan. c. Kantong plastik tempat sampel 2. Plastik tersebut kemudian dimasukkan ke dalam beaker glass 3. Kemudian disterilisasi kedalam autoclave dengan suhu 121°C selama 10 menit. 4. Pesanlah minuman Bubbe drink rasa mango yang telah diberi es. 5. Sampel diberi nomor kode yaitu : a. Untuk tiga sampel Bubble drink bermerek diberi kode E 1 ,E 2 ,E 3 b. Untuk tiga sampel Bubble drink tidak bermerek diberi kode C 1 ,C 2 ,C 3 6. Pengiriman dilakukan secepatnya maksimal dalam waktu 3 jam harus sudah sampai di laboratorium.

3.5.2 Alat dan Bahan Uji Bakteri E. coli

1. Alat a. Inkubator : 37°C dan 44°C b. Waterbath Universitas Sumatera Utara c. Tabung reaksi d. Inokulum equipment e. Pipet steril : 1 ,0 dan 10 cc f. Autoclave g. Labu Erlenmeyer h. Rak tabung reaksi i. Cawan petri j. Kawat ose k. Tabung durham 2. Bahan a. Bubble drink b. Gram buffer phosohate pH 7,2 c. Lactose Broth LB d. Brilliant Green Lactose BrothBGLB 2 e. Trypton water f. Reagent kovacs

3.5.3 Pemeriksaan Bakteri E. coli

Prinsip yang dipakai dalam penetapan bakteri E. coli adalah menghitung pertumbuhan bakteri setelah sampel diinkubasi dalam media pembenihan yang cocok pada suhu ± 37°C dan ± 44 °C selama 24-48 jam. Masukkan 10 ml Bubble drink, lalu ditambahkan 90 ml aquades atau menggunakan buffet phospat. Pemeriksaan Most Probable Number MPN atau Universitas Sumatera Utara Angka Paling Mungkin APM dilakukan terhadap bahan pemeriksaan yang telah disiapkan dengan menggunakan metode tabung ganda: 5 x 10 ml, 1 x 1 ml, 1 x 0,1 ml. Pemeriksaan tabung ganda yang terdiri dari :

1. Test Perkiraan Presumptive Test

Media yang digunakan adalah Lactose Broth LB. Cara pemeriksaan : 1. Siapkan 10 tabung reaksi yang masing-masing berisi media lactose broth sebanyak 10 ml. Tabung disusun pada rak tabung reaksi, masing-masing tabung diberi tanda sebagai berikut : a. Nomor urut b. Tanggal pemeriksaan c. Volume 2. Dengan pipet steril ambil bahan pemeriksaan yang telah disiapkan. Masukkan ke dalam : a. Tabung 1 sd 5 masing-masing sebanyak 10 ml. b. Tabung ke 6 sebanyak 1 ml c. Tabung ke 7 sebanyak 0,1 ml d. Masing-masing tabung tersebut digoyang-goyang agar spesimen dan media tercampur. 2. Inkubasi pada suhu 35-37°C selama 24 jam. Setelah 24 jam diperiksa ada tidaknya pembentukan gas pada tabung durham. 3. Catat semua tabung yang menunjukkan peragian lactose pembentukan gas. Universitas Sumatera Utara a. Bila terbentuk gas pada tabung dinyatakan positif +, dan dilanjutkan dengan test penegasan. b. Apabila test dalam waktu 24 jam tidak membentuk gas, dimasukkan ke inkubator kembali pada suhu 37 selama 24 jam. Bila terbentuk gas pada tabung durham, hasil menunjukkan positif + dan test dilanjutkan dengan test penegasan. c. Bila test negatif - berarti E. coli negatif - dan tidak perlu dilakukan test penegasan.

2. Test Penegasan Confirmative Test

Media yang digunakan adalah Brilliant Green Lactose Broth BGLB 2. Test ini untuk menegaskan hasil positif dari test perkiraan. Cara pemeriksaan : 1. Dari tiap-tiap tabung presumptive yang positif, dipindahkan 1-2 ose ke dalam tabung confirmative yang berisi 10 ml BGLB 2. Dari masing-masing tabung presumptive diinokulasikan ke dalam 2 tabung BGLB 2 . 2. Satu seri tabung BGLB 2 diinkubasikan pada suhu 35-37°C selama 24-48 jam untuk memastikan adanya coliform dan satu seri yang lain diinkubasikan pada suhu 44°C selama 24 jam untuk memastikan adanya coliform tinja coli fecal. 3. Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB 2 yang menunjukkan positif gas. Universitas Sumatera Utara

3. Pembacaan Hasil Pemeriksaan Laboratorium

Pembacaan hasil dari test penegasan dilakukan dengan menghitung jumlah tabung yang menunjukkan adanya gas baik pada seri tabung yang diinkubasi pada suhu 37°C maupun pada seri tabung yang diinkubasi pada suhu 44°C. Angka yang diperoleh dicocokkan dengan tabel MPN, maka akan diperoleh indeks MPN Coliform untuk tabung yang diinkubasikan pada suhu 37°C dan indeks MPN Escherichia coli untuk tabung yang diinkubasikan pada suhu 44°C.

4. Pemeriksaan Pertumbuhan Koloni

Dengan kawat ose steril diambil bahan secara aseptis dari biakan media BGLB, kemudian ditanamkan dengan cara zigzag pada permukaan media endo agar, lalu dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 37°C selama 48 jam. Setelah masa inkubasi selesai, diamati pertumbuhan koloni ini. Jika koloni berbentuk bulat, licin berwarna kilap logam, selanjutnya dilakukan pemeriksaan identifikasi E. coli dengan memakai pewarnaan gram.

5. Identifikasi Dengan Pewarnaan Gram

1. Koloni dari medio endo agar diambil dengan kawat ose steril lalu diletakkan pada object glass yang telah ditetesi dengan aquadest. Lalu dikeringkan dengan nyala api bunsen perlahan-lahan. 2. Kemudian ditetesi dengan larutan gentian violet 5 selama 5 menit, lalu cuci dengan mengalirkan air diatasnya. 3. Selanjutnya ditetesi dengan larutan lugol 1 selama 1 menit. Kemudian larutan lugol dicuci dengan mengalirkan air diatasnya. Universitas Sumatera Utara 4. Langkah selanjutnya adalah menetesi alkohol 99 hingga tidak berwarna lagi bersih. 5. Selanjutnya object glass ditetesi dengan larutan karbon fuchsin selama 3 menit. 6. Kemudian dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas saring. 7. Fiksasi 3 kali. 8. Lihat dengan mikroskop lensa rendah minyaklensa 100x dan diberi emersil oil. 9. Bila terlihat kuman berbentuk batang gram - berwarna merah berarti positif E. coli.

3.5.4 Cara Pengambilan Sampel Untuk Zat Pewarna

1. Persiapkan segala sesuatu untuk pengambilan sampel yaitu: a. Alat tulis b. Formulir pemeriksaan tentang lokasi pengambilan sampel dan tanggal pengambilan. c. Kantong plastik tempat sampel 2. Pesanlah minuman Bubbe drink rasa manggo yang telah diberi es. Alasan pemilihan sampel ini karena warna kuning yang dihasilkan sangat mencolok. 3. Sampel diberi nomor kode yaitu : d. Untuk tiga sampel Bubble drink bermerek diberi kode Z 1 , Z 2 , Z 3 e. Untuk tiga sampel Bubble drink tidak bermerek diberi kode P 1 , P 2 , P 3 4. Pengiriman dilakukan secepatnya maksimal dalam waktu 3 jam harus sudah sampai di laboratorium. Universitas Sumatera Utara

3.5.5 Alat dan Bahan Uji Zat Pewarna

1. Alat a. Tabung reaksi tertutup 5ml b. 4 botol pereaksi 1, 2, 3, 4 uji Methil yellow c. Botol uji standart d. Pipet e. Beaker glass 2. Bahan a. Bubble drink b. Aquadest 3.5.6 Prosedur Penelitian 1. Siapkan beaker glass dan masukkan sampel makanan 25 gr dalam volume 50 ml aquadest dan hancurkan dengan pengaduk sampai larut seluruhnya, untuk sampel minuman yang sudah cair tidak perlu dilakukan perlakuan awal 2. Siapkan tabung reaksi dan masukkan 0,5 – 1 ml sampe serta tambahkan reagent “ Met. Yellow – 1” sebanyak 2 tetes diamkan beberapa saat akan terbentuk warna merah pekat merah tajam menentukan Methyl Yellow positif. 3. Siapkan tabung reaksi yang lain dan masukkan 0,5 – 1 ml sampel serta tambahkan reagent “ Met. Yellow – 2 ” sebanyak 2 tetes dan diamkan beberapa saat akan terjadi perubahan warna kuning muda sekali menunjukkan Methyl Yellow positif. Universitas Sumatera Utara 4. Siapkan tabung reaksi yang lain dan masukkan 0,5 – 1 ml sampel serta tambahkan reagent “ Met. Yellow – 1 ” teteskan 2 tetes diamkan beberapa saat. 5. Tambahkan reagent “ Met. Yellow – 3 ” sebanyak 2 tetes dan diamkan beberapa saat. 6. Tambahkan reagent “ Met. Yellow – 4 ” sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 2 – 3 menit, jika ada Methyl Yellow akan terjadi endapan berwarna putihkristal putih menempel didinding tabung reaksi untuk lebih meyakinkan bandingkan dengan standard Methyl Yellow yang di perlakukan sebagai sampel.

3.6 Defenisi Operasional

1. Bubble drink merupakan jenis minuman yang terdiri dari air, gula, bubuk perasa, es batu, dan topping sebagai tambahan isi. 2. Pemeriksaan Laboratorium adalah pemeriksaan yang dilakukan di Laboratorium untuk mengetahui ada atau tidaknya kandungan Escherichia coli dan zat pewarna berbahaya . 3. Adanya kandungan bakteri Escherichia coli adalah terdapatnya bakteri Escherichia coli pada Bubble drink. 4. Tidak adanya kandungan bakteri Escherichia coli adalah tidak terdapatnya bakteri Escherichia coli pada Bubble drink. 5. Adanya kandungan pewarna berbahaya adalah terdapatnya zat pewarna berbahaya pada Bubble drink. Universitas Sumatera Utara