24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
- perbandingan 8:2
- perbandingan 6:4
- perbandingan 4:6
- perbandingan 2:8
c. etil asetat 100 Setiap perbandingan dibuat sebanyak 200 mL, kecuali n-heksan
digunakan lebih dari 200 mL yaitu sebanyak 8,87 L karena senyawa sasaran berada pada pengembang nonpolar.
d. Proses Elusi Pelarut perbandingan pertama dimasukan ke dalam kolom sampai
hasil analisa bercak menggunakan KLT tidak muncul lagi bercak dengan nilai Rf senyawa sasaran. Setelah itu dilanjutkan dengan perbandingan
selanjutnya sampai perbandingan terakhir. Hasil elusi ditampung dengan vial-vial dan diberi nomor secara berurutan. Hasil eluat diidentifikasi
menggunakan kromatografi lapis tipis untuk melihat bercak yang terlihat di bawah lampu UV 254 nm.
Hasil kromatografi kolom kedua mendapatkan 559 vial untuk fase gerak n-heksan, yang kemudian terbagi ke dalam 9 fraksi berdasarkan
hasil identifikasi pola kromatogram menggunakan KLT. Perbandingan selanjutnya meghasilkaan 65 vial yang terbagi kedalam 7 fraksi.
Fraksi yang memiliki 1 bercak yaitu fraksi D8. Fraksi D8 selanjutnya dianalisa menggunakan GCMS, spektrofotometri IR, dan
.
3.3.5. Uji Kemurnian Senyawa Hasil Isolasi
Untuk menentukan kemurnian dari senyawa yang didapatkan, dilakukan identifikasi menggunakan GCMS dengan melihat waktu retensi
dan persentasi dari senyawa.
1. GCMS
Optimasi alat GCMS yaitu menggunakan k olom HP-5MS 30 m x
0,25 mm ID x 0,25 µm; suhu awal 70 C selama 2 menit, dinaikkan ke
suhu 285 C dengan kecepatan 20
Cmin selama 20 menit. Suhu MSD
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
285 C. Kecepatan aliran yang digunakan 1,2 mLmin dengan split 1:100.
Parameter scanning dilakukan dari massa paling rendah yaitu 35 sampai paling tinggi 550.
2. Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi
Uji kemurnian senyawa dapat dilakukan dengan menggunakan KLT dua dimensi. Langkah kerjanya yaitu menyiapkan plat KLT silica gel
60 dengan ukuran persegi 5 cm-5 cm dan disiapkan pula fase
pengembang dengan perbandingan n-heksan:etil asetat 4:1. Sampel kemudian ditotolkan pada salah satu ujung sisi plat KLT. Proses
pengembangan yaitu menggunakan 2 arah, arah pertama mengikuti sistem pengembangan askenden dari sisi bawah tempat sampel ditotolkan. Setelah
kering, selanjutnya pengembangan kedua dengan menggunakan arah pengembangan askenden kembali yang tegak lurus dari arah pertama.
Kemudian bercak dilihat di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 nm.
3.3.6. Penentuan Struktur Molekul Senyawa Hasil Isolasi
Penentuan struktur senyawa yang didapatkan dilakukan dengan menganalisa menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry,
spektrofotometri IR, dan Proton Nuclear Magnetic Resonance .
1. Analisa Senyawa Fraksi D8 Menggunakan GCMS
K olom yang digunakan
pada analisa menggunakan GCMS adalah
HP-5MS 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 µm dengan suhu awal 70 C selama
2 menit, dinaikkan ke suhu 285 C dengan kecepatan 20
Cmin selama 20 menit. Suhu MSD 285
C dan kecepatan aliran 1,2 mLmin dengan split 1:100. Parameter scanning dilakukan dari massa paling rendah yakni 35
sampai paling tinggi 550. Senyawa diidentifikasi berdasarkan waktu retensi dan persentasi kesamaan pola fragmentasi dengan senyawa dari
dalam komputer Lybrary.
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Analisa Fraksi D8 dengan Spektrofotometri IR
Sampel disiapkan kira-kira 1-2 mg, kemudian pada sampel tersebut ditambahkan bubuk KBr murni kira-kira sebanyak 200 mg dan diaduk
hingga homogen. Sampelpelet KBr diambil yang telah homogen ditempatkan dalam tempat sampel pada alat spektrofotometri inframerah
untuk dianalisa Hidayati, 2012.
3. Analisa Struktur Senyawa Fraksi D8 Msenggunakan
Identifikasi senyawa selanjutnya yaitu menggunakan instrumen NMR 500 MHz JEOL JNM-ECA 500. Langkah yang dilakukan adalah
10 mg sampel dilarutkan dalam pelarut kloroform bebas proton. Setelah dilarutkan kemudian dimasukkan kedalam tube khusus NMR untuk
dianalisa .
3.3.7. Uji Antiinflamasi
Pada uji antiinflamasi ini mengacu pada jurnal Williams et al. 2008, dengan langkah yang pertama dilakukan yaitu membuat reagen
yang akan digunakan sebagai berikut :
1. Pembuatan larutan TBS Tris Buffer Saline pH 5,7
Ditimbang sebanyak 605 mg tris base dan 4,35 g NaCl. Kemudian tris base dan NaCl yang telah ditimbang dilarutkan dalam 500 mL
akuabides. Selanjutnya diukur pH dan dibuat pH menjadi 5,7 dengan menggunakan asam asetat glasial.
2. Pembuatan larutan Na-diklofenak sebagai kontrol positif
Larutan Na-diklofenak dibuat dalam beberapa variasi konsentrasi dengan larutan induk dibuat sebesar 10.000 ppm dalam pelarut metanol pa.
Selanjutnya dari larutan induk dibuat konsentrasi 1000, 100, dan 10 ppm dengan teknik pengenceran.
3. Pembuatan larutan EPMS dan senyawa hasil isolasi
Larutan EPMS dan senyawa fraksi D8 masing-masing dibuat dalam beberapa variasi konsentrasi dengan larutan induk dibuat sebesar
10.000 ppm dalam pelarut metanol pa. Selanjutnya dari larutan induk dibuat konsentrasi 1000, 100, dan 10 ppm dengan teknik pengenceran.
