Uji kualitatif aktivitas antibakteri

e. Preparasi bakteri uji Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Kultur bakteri induk dari media miring diambil sebanyak 1 ose lalu dikulturkan pada media TSB cair. Kultur bakteri diinkubasi selama 18 jam. f. Pembuatan larutan induk bakteri Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Sebanyak 2 tabung reaksi disiapkan, masing-masing diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya menggunakan larutan standar Mc Farland 0,5 konsentrasi mikroba 1,6. 10 8 CFUml dengan penambahan bakteri ke dalam tabung reaksi. g. Penyimpanan kultur bakteri Sisa kultur bakteri yang belum digunakan untuk diuji, diambil 0,5 mL lalu dimasukkan ke dalam microtube. Gliserol sebanyak 5 vv dari 0,5 mL kultur bakteri ditambahkan, yaitu 25. 10 -3 mL pada masing-masing microtube. Campuran dihomogenkan lalu diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator bersuhu 37°C. Setelah itu kultur bakteri disimpan dalam freezer. h. Pembuatan kontrol kontaminasi media Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara pour plate lalu dibiarkan memadat. Media diinkubasi selama 18 jam. i. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat pada cawan petri steril. 100 µL bakteri diinokulasikan secara spreading dengan menggunakan cotton buds steril. Inkubasi dilakukan selama 18 jam. j. Pembuatan kontrol positif Media agar sebanyak 15 mL TSB lalu dibiarkan memadat. 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara spreading menggunakan cotton buds steril. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL akuades. Sebanyak 75; 100;150 µg amoksisilin diambil lalu diteteskan pada paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri. Inkubasi dilakukan selama 18 jam. k. KLT ekstrak bunga kenanga Ekstrak bunga kenanga dengan konsentrasi 5 mgmL dalam etanol disiapkan untuk ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 75; 100; 150 µg dengan menggunakan mikropipet. Pelat KLT dielusi dengan fase gerak kloroform : metanol 95 : 5 vv. Pelat KLT kemudian dikeringkan pada suhu ruang secara aseptis dibuat 2 kali replikasi: sebagai acuan dan sebagai pelat uji bioautografi. l. Bioautografi Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan secara aseptis ditempelkan pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading. Kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut diangkat secara aseptis. Inkubasi dilakukan selama 18 jam dan dibandingkan kontrol negatif dan pelat KLT acuan. Hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media yang telah diinokulasikan bakteri.

8. Identifikasi golongan senyawa ekstrak

Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi menggunakan reagen semprot. Reagen semprot yang digunakan yaitu Dragendorff, alumunium chloride , ferric chloride, sitroborat, iodium, dan vanilin sulfat, kemudian diamati perubahan warna dan dihitung nilai Rf dari bercak.

9. Pembersihan klorofil dengan karbon aktif

Sebanyak 28 g ekstrak bunga kenanga diambil dan ditampung dalam gelas beaker. Sebanyak 1,6 g karbon aktif ditumbuk halus dan dipanaskan dalam oven dengan suhu 105 C selama 30 menit. Ekstrak bunga kenanga dilarutkan dengan pelarut kloroform : metanol 1 : 1 vv sambil diaduk dengan batang pengaduk. Taburkan karbon aktif yang sudah diaktivasi lalu diaduk dengan batang pengaduk. Campuran disaring lalu filtrat dipekatkan menggunakan tangas air.

10. Kromatografi kolom

a. Preparasi sampel untuk uji kromatografi lapis tipis Ekstrak hasil pembersihan klorofil ditimbang 2,5 mg dilarutkan dalam 0,5 mL metanol. b. Uji kromatografi lapis tipis KLT untuk optimasi fase gerak kolom Hasil preparasi sampel ditotolkan pada pelat KLT. Disiapkan 4 fase gerak yaitu: n-heksana : kloroform 50:50 vv, n-heksana : kloroform 25:75 vv, kloroform , dan kloroform : metanol 98:2 vv. Pelat KLT dielusi dengan fase gerak tersebut dan diamati. c. Preparasi sampel untuk kromatografi kolom Ekstrak hasil sebanyak 300 mg pembersihan klorofil ditimbang dan dicampurkan dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan perbandingan 1:1. d. Preparasi kolom kromatografi Kolom kromatografi disiapkan dengan urutan dari bawah yaitu kapas yang telah dibilas n-heksana, silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan tinggi 3 cm, sampel yang telah dicampur dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi 0,5 cm, silika gel 60 untuk kolom kromatografi 1 cm, dan ditutup dengan kapas yang telah dicuci dengan n-heksana. e. Kromatografi kolom Kolom kromatografi yang telah disiapkan, dialiri fase gerak dengan urutan sebagai berikut: n-heksana: kloroform 70 : 30 vv, 60 : 40 vv, 50:50 vv, 40:60 vv, kloroform, kloroform : metanol 90:10 vv. Masing – masing fase gerak disiapkan 5 mL. Tiap 2 mL hasil elusi kolom kromatografi ditampung pada tabung yang telah diberi tanda. f. Konfirmasi hasil kromatografi kolom dengan kromatografi lapis tipis KLT Setiap tabung hasil kolom kromatografi yang dikumpulkan dilakukan KLT. Profil KLT hasil kolom kromatografi yang sama disatukan kemudian dipekatkan. Hasil pemekatan ditimbang lalu dihitung rendemen.