Uji kualitatif aktivitas antibakteri
e. Preparasi bakteri uji
Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Kultur bakteri induk dari media miring diambil sebanyak 1 ose lalu dikulturkan pada media
TSB cair. Kultur bakteri diinkubasi selama 18 jam. f.
Pembuatan larutan induk bakteri Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Sebanyak 2
tabung reaksi disiapkan, masing-masing diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya menggunakan larutan standar Mc Farland 0,5
konsentrasi mikroba 1,6. 10
8
CFUml dengan penambahan bakteri ke dalam tabung reaksi.
g. Penyimpanan kultur bakteri
Sisa kultur bakteri yang belum digunakan untuk diuji, diambil 0,5 mL lalu dimasukkan ke dalam microtube. Gliserol sebanyak 5 vv dari 0,5 mL
kultur bakteri ditambahkan, yaitu 25. 10
-3
mL pada masing-masing microtube. Campuran dihomogenkan lalu diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator
bersuhu 37°C. Setelah itu kultur bakteri disimpan dalam freezer. h.
Pembuatan kontrol kontaminasi media
Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara pour plate
lalu dibiarkan memadat. Media diinkubasi selama 18 jam. i.
Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji
Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat pada cawan petri steril. 100 µL bakteri diinokulasikan secara
spreading dengan menggunakan cotton buds steril. Inkubasi dilakukan selama
18 jam. j.
Pembuatan kontrol positif Media agar sebanyak 15 mL TSB lalu dibiarkan memadat. 100 mikroliter
bakteri diinokulasikan secara spreading menggunakan cotton buds steril. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL akuades. Sebanyak
75; 100;150 µg amoksisilin diambil lalu diteteskan pada paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri. Inkubasi dilakukan selama 18
jam. k.
KLT ekstrak bunga kenanga Ekstrak bunga kenanga dengan konsentrasi 5 mgmL dalam etanol
disiapkan untuk ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 75; 100; 150 µg dengan menggunakan mikropipet. Pelat KLT dielusi dengan fase gerak kloroform :
metanol 95 : 5 vv. Pelat KLT kemudian dikeringkan pada suhu ruang secara aseptis dibuat 2 kali replikasi: sebagai acuan dan sebagai pelat uji
bioautografi. l.
Bioautografi Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan secara aseptis ditempelkan
pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading. Kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut diangkat
secara aseptis. Inkubasi dilakukan selama 18 jam dan dibandingkan kontrol negatif dan pelat KLT acuan. Hasil positif ditandai dengan adanya zona
hambat pada media yang telah diinokulasikan bakteri.